ヒトの胎児微生物叢に対する介入レジメンの影響を推定するインビトロバッチ培養モデル

様々なヒト疾患における腸内微生物叢の新たな役割を考えると、プロバイオティクス、プレバイオティクス、ダイエットおよび薬物のようないくつかの腸内微生物叢調節剤は、腸内微生物叢関連の健康病気を改善するのに役立ちます。しかし、このような腸内微生物叢変調器の影響を予測するための迅速かつ手頃な価格のスクリーニングシステムはありませんが、このシステムは、特定の介入が最終的にホストの健康に影響を与える可能性のある腸内微生物叢にどのような影響を与えるかを予測するのに十分簡単です。このプロトコルは、腸内微生物叢変調器と微生物叢および宿主の健康への影響を調査する実験室にとって、シンプルで手頃な価格で実用的です。

無菌および嫌気性条件の維持は、この実験のために重要である。また、便標本は、すぐに収集時に、新たに使用する必要があります。それ以外の場合、実験が後で計画されている場合、サンプルは、周囲温度や空気に暴露することなく、収集時にすぐにマイナス80で保存する必要があります。

アリコートの準備とピペッティングの際の取り扱い精度は、精度と再現性を維持するためにも重要です。昼間は12時間未満かかります。彼らが24時間でサンプルを必要とするならば、私たちは一晩で文化を構築することができます。

次いで、短鎖脂肪酸とマイクロバイオーム定量を続ける。このプロセスは、私の研究室の2人の偉大なユニ学生、ショコウ・アフマディとラビナ・マイナによって実証されます。ヒュームフードの下で発酵培地を調製するために、磁石混合物上の試薬ボトルに、混合溶液A、溶液B、微量ミネラル溶液、水溶性ビタミン溶液、葉酸ビオチン溶液、リボフラビン溶液、ヘミン溶液、短鎖脂肪酸混合、およびレサズリンを混合する。

その後、ボトル酵母エキス、炭酸ナトリウム、システイン塩酸塩一水和物、トリプチケースに添加する。蒸留水を296.1ミリリットル加え、通常の塩酸塩または水酸化ナトリウムでpHを調整して7.0前後になるようにします。ビーカーを無菌ワークステーションに移し、0.22マイクロメートルの孔径の真空フィルターを使用して、滅菌のために培地を濾過します。

1リットルの嫌気性希釈液を調製するには、5グラムの塩化ナトリウム、2グラムのグルコース、および0.3グラムのシステイン塩酸塩水和物をイオン化水中で溶解する。121.1°Cのキャップで試薬ボトルを15分間オートクレーブし、嫌気性チャンバーの中に保管します。発酵実験を開始する前に、発酵実験に必要なすべての材料、溶液、およびツールを嫌気室内に少なくとも48時間保管し、酸素を除去します。

発酵実験の少なくとも24時間前に、イヌリンの300ミリグラムの重量を量り、それを50ミリリットルのチューブに移し、嫌気室の中に入れる。26ミリリットルの殺菌発酵培地をチューブに加え、渦を混ぜます。約24時間の繊維の水和を可能にする。

発酵実験の当日、便接種を調製する。まず、50ミリリットル円錐形チューブに5グラムの新鮮な胎児サンプルを量る。嫌気性希釈液をチューブに加えて、最終体積50ミリリットルに達します。

ボルテックスは15分間、または完全に均質化されるまでである。接種チューブを嫌気室内で摂氏37度に保ち、1時間に1回穏やかに反転して繊維と接種を再中断します。3時間、6時間、9時間、または24時間後に、適切な量の発酵培地を取り出し、摂氏4度で10分間14,000倍gのサンプルを遠心分離する。

直ちに上清とペレットを液体窒素に凍結し、スナップ凍結後、短鎖脂肪酸分析用の上清とマイクロバイオーム分析用のペレットをマイナス80°Cで保存します。このプロトコルは、特定のプレバイオティクスの効果を実証するために使用されます。健康なヒト被験者の便は、イヌリンによる治療後、9時間の間比較的安定したpHを示したが、24時間後に劇的に低下した。

イヌリンの接種は、イヌリン処理した便標本における短鎖脂肪酸および乳酸のレベルを有意に増加させ、非処理された便の微生物叢培養と比較する。主な座標分析は、イヌリン処理サンプルと未処理サンプル間のベータ多様性の加重および非加重UniFrac尺度に対する異なる微生物叢組成を示す。アルファ多様性とPD全体の樹木を通じた系統学的多様性の指標、種の豊かさ、運用分類単位、種の均一性、ならびに主要なフィラおよび属の相対的な豊富さは、すべてイヌリン処理および未治療サンプルの間に異なる腸内微生物叢シグネチャを提示する。

分類学的クラドグラムは、16S配列の線形判別効果サイズ分析から導出され、異なるサンプル群間の異なる豊富な分類を表す。すべての手順を慎重に実行します。最も重要なことは、厳格な無菌および嫌気性条件を維持することです。

上清および実験から繊維の発酵の結果として短鎖脂肪酸のレベル変化を治療するために使用することができる。さらに、ペレット中の腸内微生物叢組成物の変化を分析するために使用することができる。培養培地の製造に使用される化学物質の中には、潜在的に危険な化学物質があります。

MSDSシートを使用し、それに応じて注意してください。