当社のプロトコルは、3D細胞培養のための簡単な方法を提供し、下流の分析に非常に適しています。これにより、異機種患者サンプルおよびその特定の薬剤応答の評価が容易になります。この技術の利点は、スフェロイドが小さな細胞数から形成され、希少な一次サンプルの保存と患者固有の薬物応答のための高スループットスクリーニングの両方を可能にできることである。
吊り下げ低下モデルは、3D薬物拡散を伴う生理学的環境を作り出し、腫瘍段階に対応する応答を行う。これにより、標的療法および患者固有の治療法の開発が可能になります。この方法は、卵巣癌、異種性および化学抵抗性の発達を研究するのに理想的である。
しかし, 他の癌や薬剤耐性細胞集団を研究するために使用することもできます。.スフェロイドをめっきする場合、正確な体積をピペットすることが重要です。これにより、回転楕円体間の一貫性が確保されます。
スフェロイドとそれぞれの液滴は本質的に壊れやすく、適切な取り扱いなしに失われやすいので、吊り下げドロッププレートを適切にプレート、維持、分析する方法を示します。この手順を実証するマイケル・ブレゲンザー、私たちの研究室の大学院生です。6ウェルプレートの各井戸に4〜5ミリリットルのオートクレーブ脱イオン水を充填し、蓋とプレートの底の間に吊り下げドロッププレートを挟みます。
吊り下げドロッププレートの縁の周りに800〜1000マイクロリットルの水を加え、湿気の多い環境を提供し、蒸発を最小限に抑えます。次に、2D成長細胞をトリプシンで取り外し、FBSを含む培地を6〜8ミリリットル加えて回収する。細胞を10ミリリットルの血清ピペットで吸引し、15ミリリットルの円錐管に沈着させる。
細胞を数えるために、ヘモサイトメーターを使用してください。原稿の方向に従って細胞懸濁液を調製し、ピペットと穏やかに混ぜて均質な分布を確保します。ピペットの先端を45度の角度でウェルに置き、ピペット20マイクロリットルの懸濁液を各吊り下げドロップウェルに入れる。
6ウェルプレートの蓋を元に戻し、伸縮性のある熱可塑性ストリップを使用してエッジを密封します。標準的な二酸化炭素加湿インキュベーターにインキュベートし、各スフェロイド含有ウェルに2〜3マイクロリットルの細胞培養培地を加えることによって2〜3日ごとに吊り下げ滴を供給する。細胞の増殖と生存率を定量化するために、増殖分析のために指定されたウェルに2マイクロリットルのろ過レサズリンベースの溶液を加え、原稿の方向に従ってインキュベートする。
インキュベーション期間の後、ハンギングドロップサンドイッチをバイオセーフティキャビネットに開き、蓋を残した384ウェルプレートをプレートリーダーに持って行きます。プレートリーダーに入れ、プレートを読みます。テストをポップアップ ウィンドウに保存し、データをスプレッドシートにエクスポートします。
プレートを6ウェルベースに戻し、インキュベーターに入れます。すべての時間ポイントが一日読み取られたら、インキュベートする前にプレートを再シールします。フローサイトメトリー分析のためにスフェロイドを調製するには、1000マイクロリットルピペットを使用して各ウェルからそれらを収集し、分解のために15ミリリットル円錐形チューブに堆積させます。
アリコート細胞は5つのマイクロ遠心チューブに懸濁し、各チューブが少なくとも50,000個の細胞を含む。マイクロ遠心分離機でチューブを400倍Gで5分間遠心し、上清を吸引し、100マイクロリットルのアルデフルオールバッファーでペレットを再懸濁します。原稿の指示に従ってチューブにラベルを付けます。
APC ISOチューブに0.5マイクロリットルのAPCアイソタイプ抗体を加え、CD133抗体を1マイクロリットルずつALDH CD133チューブに加えます。次に、DEAB試薬5マイクロリットルとALDHの0.5マイクロリットルをDEABチューブに加え、ALDHの1マイクロリットルをALDH CD133チューブに加えます。数秒間すべてのチューブをボルテックスし、45分間摂氏37度でそれらをインキュベートします。
インキュベーション後、すべてのチューブを再び渦巻きし、5分間Gの400倍に遠心分離する。原稿の方向に従ってFACSチューブにラベルを付け、断熱発泡容器を氷で満たします。マイクロ遠心チューブから上清を吸引する。
次に、FACSバッファーの400マイクロリットルで未染色制御を再中断し、残りの細胞を400マイクロリットルのFACS DAPIバッファーに再中断します。チューブを氷の上に置き、フローサイトメーターで分析できます。FlowJo を使用して、フローサイトメーターからのデータを分析します。
未染色ファイルをダブルクリックし、Y 軸を横のスキャッタ高さに設定するか、または SSCH 軸を、X 軸を前方の拡散高さまたは FSCH に設定します。各軸の横にある T ボタンをクリックして、スケールを調整し、異なるセルの母集団間の分離を最大化します。次に、[ポリゴン ゲート] ボタンをクリックし、セルの母集団の周囲にポリゴン ゲートを描画し、人口セルにラベルを付けます。
ワークスペースでセルの母集団をダブルクリックし、FSC 軸を FSC 幅に、SSC 軸を FSC の高さに変更します。四角形のゲートを選択すると、Y 軸全体にまたがって、最も左の密度の高いセルの母集団の周囲にのみ四角形が描画されます。このゲートに単一セルにラベルを付けます。
次に、ネストされた単一セルのゲートで、このセルを右クリックしてコピーし、ワークスペース内の各サンプルの下に貼り付けます。DAPI サンプルの下にネストされた単一セルのゲートをダブルクリックすると、そのサンプル チューブから単一セルの母集団が表示されます。FSC 軸チャネルを DAPI エリア チャネルに変更し、SSC 軸チャネルをヒストグラムに変更します。
DAPI 軸の横にある T ボタンをクリックし、[軸のカスタマイズ] をクリックしてスケールを調整し、DAPI 正と DAPI の負のピークの間の分離を最大化します。ポップアップウィンドウで[適用]をクリックし、[範囲ゲート]ボタンを選択します。DAPI負のピークに広げ、このゲートライブセルにラベルを付けます。
ライブセルゲートをコピーし、APC ISO DEABおよびALDH CD133チューブの下の単一セルゲートの下に貼り付け、各チューブ内の生細胞の同じ部分を選択します。次に、APC ISO サンプル ファイルの下にネストされたライブ セルの作成をダブルクリックし、X 軸を ALDH 領域に、Y 軸を APC 領域に切り替えます。[象限ゲート]を適用し、母集団の約0.5%がプロットウィンドウの左上にあるなどのゲートの交点を調整します。
次に、必要に応じて象限に名前を付け、DEAB ファイルの下にネストされたライブ セルの母集団に象限ゲートをコピーして貼り付け、セルの母集団の約 0.15% が ALDH 正象限内に収まるように垂直線を調整します。最後に、ALDH CD133ファイルに四分の一のゲートをコピーして貼り付け、ALDHとCD133プロポーションに基づいて癌幹細胞の割合を評価するライブ細胞集団を。このプロトコルは患者由来の癌幹細胞の高い効率分析のために使用することができる。
ウェルあたりわずか10個の細胞が信頼性の高いスフェロイドを形成することができ、細胞が増殖するにつれて、スフェロイドのサイズが拡大します。増殖能力は、レサズリン系の蛍光アッセイで容易に定量することができる。スフェロイド形態に対する薬物の効果は、位相コントラスト画像化で可視化し、未処理および治療された細胞における再サズリンの蛍光を比較することによって定量化することができる。
細胞死は、カルセインAMおよびエチジウムホモジマーIをスフェロイドに添加し、続いて共焦点顕微鏡でイメージングすることによって検証することができる。最後に、スフェロイドを採取し、フローサイトメトリーで分析するために単一の細胞懸濁液に分散することができ、特定の細胞集団に対する異なる薬物治療の有効性を識別することが可能になる。液滴の損失、中程度の蒸発、スフェロイドサイズの変動を避けるためには、プレートを慎重に処理し、ピペットを正確に処理し、吊り下げドロッププレートを完全に密封することが重要です。
薬物治療による遺伝子発現および可溶性シグナル伝達の変化を評価するために、単細胞RNAシーケンシングおよび酵素結合免疫吸着アッセイは、治療薬の開発を容易にするために使用することができる。この技術により、腫瘍学、精密医療、医薬品開発の研究は、小さな生検の高スループット薬物スクリーニングを通じて、患者の異質性と患者間の不均一性と共に化学抵抗性を探求することができます。このプロトコルを実行する場合は、すべての標準的な個人用保護具を着用してください。
手袋、安全メガネ、ラボコート、ズボン、近い靴を含む。
