このプロトコルは、自己免疫疾患を治療する上で望ましい安全なアプローチである多数の機能抗原特異的T細胞を生成することを可能にする。この技術の主な利点は、非常に効率的なトランスダクションプロセスと多数の機能T細胞を提供することです。この技術は、抗原が知られている1型糖尿病および他の自己免疫疾患を治療するために拡張することができる。
さらに、CAR T細胞は、特定のタイプの癌に対する有望な治療法であり得る。この方法は、他のCALを発現する免疫細胞を生成するために使用することができる。良い受け入れられた技術を持ち、プロトコル全体を読み、実験全体を事前に計画することが重要です。
この2週間の長いプロトコルにはミニステップが含まれており、成功は各ステップの適切なパフォーマンスに依存します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、学習者が正しく従うために重要です。原稿に記載されているように、トランスフェクションのためにフェニックス細胞を準備します。
細胞の吹き飛ばしを最小限に抑えるために、培地を追加および除去する側壁をマークすることをお勧めします。ゼロ日に細胞から上清を吸引し、5ミリリットルのPBSで洗浄します。減らされた血清培地をプレートの側壁に滴下して7ミリリットル慎重に加え、細胞をインキュベーターに戻します。
1.5ミリリットルの減らされた血清培地を2つの14ミリメートルの丸いポリプロピレンチューブに加えます。40マイクロメートルのトランスフェクション試薬をチューブの1つに加え、15マイクログラムの抗体はCARプラスミドを他の5マイクログラムの包装プラスミドと一緒にリダイレクトしました。室温で5分間チューブをインキュベートし、プラスミドチューブにトランスフェクション試薬を加えます。
溶液を上下に3回軽くピペットで混ぜ、室温で少なくとも20分間インキュベートします。フェニックス細胞に3ミリリットルの混合物を加え、組織培養インキュベーターに入れます。4~5時間後、細胞に1ミリリットルのFCSを加え、摂氏37度で一晩培養します。
翌日、上清を細胞から取り出し、4ミリリットルの新鮮な温め込み培養培地を加える。フェニックス細胞から培地を含むウイルスを収集し、それを濾過して残留細胞の破片を除去することで、2日目にウイルスを収穫する。組み換えヒトIL-2ストックをウイルスに加え、1ミリリットル当たり200の国際単位の最終濃度を得て、すぐにトランスダクションに使用します。
フェニックス細胞に新鮮な培地を4ミリリットル加え、一晩保育器に入れます。翌日にウイルスの収集を繰り返して2回目のトランスダクションを行い、細胞を廃棄します。マウスCD8 T細胞を播種する1日前に、抗マウスCD3とCD28抗体の混合物を24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットル加え、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。
ゼロ日目には、マウス脾臓を収穫し、氷の上の細胞培養皿にPBSの10ミリリットルに浸す細胞ストレーナーの上に置きます。細胞培養フードでは、各脾臓を3~5個に切り、注射器の滅菌プランジャーを使用して、ワイヤーメッシュを通して組織を押し込みます。1~4個の希釈赤血球リシスバッファーで脾細胞を再懸濁し、室温で5分間インキュベートし、細胞カウント用にTrypan Blueで10マイクロリットルの細胞懸濁液を希釈して、赤血球を静かに除去します。
そして、残りの細胞を350回gで7分間遠心してペレットする。マウスCD8 T細胞分離キットを使用してCD8 T細胞を濃縮し、ビオチン抗体カクテル100マイクロリットルから8番目の細胞に10マイクロリットルのバッファー400マイクロリットルの細胞ペレットを一時停止します。細胞懸濁液をよく混ぜ合わせ、摂氏4度で5分間インキュベートし、抗体結合を可能にします。
その後、300マイクロリットルの標識バッファーと200マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズを10回10〜8細胞に加えます。よく混ぜて、摂氏4度でさらに10分間インキュベートします。一方、セパレータに分離カラムを設置し、3ミリリットルのラベリングバッファで洗浄します。
40マイクロメートルの細胞ストレーナーをカラムの上部に置き、ビーズと細胞混合物の1ミリリットルをストレーナーを通して分離カラムに入れます。プレチル15ミリリットルチューブに流れを収集し、同じチューブに排水を収集し、メーカーの指示に従って列を洗浄します。細胞を数え、5分間350回gで遠心分離して回収する。
T細胞培地と遠心分離機を2ミリリットルで再び洗います。次に、1ミリリットル当たり250,000〜500,000細胞の濃度で、温め込まれたT細胞培地で再懸濁する。以前に調製したCD3およびCD28抗体被覆プレートを1ミリリットルの無菌PBSで3回洗浄し、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。
渦巻き運動を使用して、細胞を均等に分配します。コントロールとして、同じ数のCD8 T細胞をプレートの単一の非コーティングウェルにプレートし、10%の炭酸ガスタンクインキュベーターで37°Cで細胞を48時間インキュベーターします。1日目には、24ウェルプレートのウェルに0.5ミリリットルのフィブロネクチンを加え、摂氏4度で一晩インキュベートして、ヒトフィブロネクチンフラグメントコーティングプレートを準備します。
翌日、フィブロネクチン溶液を取り除き、1ウェルあたり2%BSAとPBSの1ミリリットルを加えます。プレートを室温で30分間インキュベートし、処理した井戸を1ミリリットルの無菌PBSで洗浄します。洗浄液を取り外した後、プレートを使用する準備が整いました。
トリパンブルーを使用して、活性化されたCD8 Tセルをカウントします。遠心によってそれらを収集します。そして、トランスダクションのためにミリリットル当たり500万個の生存細胞でそれらを再懸濁させる。
活性化CD8細胞懸濁液の100マイクロリットルをフィブロネクチン被覆プレートの各ウェルに加えます。その後、培地を含む以前に調製されたウイルスの1.5〜2ミリリットルを加え、渦巻き運動を使用して混合して細胞を均等に分配します。Ziplocバッグにプレートを密封し、摂氏37度で90分間2,000倍gで遠心分離機を入れます。
遠心分離機からプレートを取り出し、生物学的安全キャビネットに持って行きます。ビニール袋を慎重に取り出し、プレートの外側が媒体で汚染されていないことを確認します。プレートを摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに移します。
4時間後、各ウェルから1ミリリットルの培地を取り出し、プリウォーム完備のT細胞培地1ミリリットルに交換し、プレートをインキュベーターに戻します。このプロトコルの重要な側面は、高い活性化ウイルス、健康な活性化T細胞、および適切なトランスダクション方法である。細胞は、PEサイズ7共役抗CD8、AF647共役抗CD3、およびBV 421結合型抗CD28と共染色して、フローサイトメトリック解析を行った。
約70%のCD8T細胞がCAR発現を示すGFPを同時発現した。また、CD28とCD3も共同で表現しました。重要なことに、すべての試験GFP陽性細胞はまた、細胞表面上のCARの発現を示すが、対照四量計とは対照しないI-Ag7インスリンBR3四量主細胞と共染色した。
さらに、並び替え試験および制御CAR T細胞は、それぞれ、その同一性リガンドを発現する標的細胞と共培養した後にのみ高レベルのインターフェロンガンマを分泌し、トランスデューシングされた細胞が親抗体の標的に向けられたCD8エフェクターT細胞を有することを確認した。ウイルス産生細胞の導入、一次CD8T細胞の単離、およびこれらのT細胞の活性化は、この実験の最も重要なステップである。健康な活性化T細胞と適切な試薬を用いたこれらのT細胞の導入を有することで、良好な結果が得られます。
この方法は、他の T 細胞を変換するために使用できますが、特定の T 細胞型に合わせてカスタマイズする必要があります。このプロトコルは、抗原特異的なキメラ抗原受容体T細胞療法による1型糖尿病の予防に道を開く。
