このプロトコルは、睾丸のオルガノイドの生成を可能にするので重要であり、精巣形態形成を研究し、高トロポ薬および毒性スクリーニングのためのプラットフォームとして使用することができる。この技術の主な利点は、再現性が高く、比較的少ない数の細胞を必要とし、精巣特異的なアーキテクチャを持つ多数の精巣オルガノイドを生成するために使用できることです。この方法は、必要な最適化を伴う多能性幹細胞や膵島細胞などの他のシステムを研究するために適用することができます。
精巣組織酵素消化手順を実証することは、私の研究室の博士課程の学生、アンナ・ヴォイクトになります。精巣を滅菌ビーカーに集め、1%ペニシリンストレプトマイシンを含むPBSで洗浄します。洗浄後、1%ペニシリンストレプトマイシンを含有するPBSを用いた100ミリの組織培養皿に精巣を移した。
チュニカ膣および精巣上体を除去するためにオートクレーブハサミと鉗子を使用してください。単離した精巣を新しい100ミリメートル皿に移し、1%ペニシリンストレプトマイシンを含むPBSで十分に洗います。テティスをチュニカの直下の縦軸に沿って切ります。
その後、2つの鉗子を使用してチュニカから精巣を剥がし、1%ペニシリンレンサ球菌シンを含む1ミリリットルのDMEMを含む新しい100ミリメートル皿に入れます。皮をむいた精巣を滅菌ハサミで1~2ミリメートルのティッシュ片にミンチします。切り刻んだ後、結合組織の白い断片を除去するために滅菌鉗子を使用する。
50ミリリットルチューブで溶液Aに切り刻まれた組織片を移し、DMEMで最大50ミリリットルを上げて、コラゲナーゼ4Sの1ミリリットル当たり0.4ミリグラムの濃度とコラゲナーゼ4Wの1ミリリットル当たり0.8ミリグラムの濃度を得る。組織片を含むチューブを37°Cの水浴に30分間入れます。5分ごとにチューブをそっと反転します。
30分後、チューブを90回Gで遠心分離し、摂氏25度で1.5分間休憩します。上清を捨て、溶液Bの40ミリリットルを、DMEMで最大50ミリリットル上げて、コラゲナーゼ4Wのミリリットル当たり1.2ミリグラムの濃度を得る。チューブを37°Cの水浴に30分間置き、5分ごとに軽く反転します。
チューブを90倍Gで遠心し、摂氏25度で1.5分間休憩します。その後、上清を捨て、1%ペニシリンストレプトマイシンでPBSで1回洗浄する。慎重に上から細管を収集し、新しい50ミリリットルのチューブに配置します。
最大50ミリリットルのPBSでチューブを上に上げろ。1.5分間摂氏25度で休憩を取った90倍のGで管管を遠心分離します。上清を捨て、新鮮なPBSを加えて2回洗います。
最後のPBS洗浄後、上清を除去し、PBSの5ミリリットルで半尿細管を再中断します。その後、15ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを細管に加えます。チューブを摂氏37度の水浴に入れ、2分ごとにそっと反転します。
5分後、組織培養プレート上のサンプルを10マイクロリットルで顕微鏡下で単一細胞に対する尿細管の酵素消化を評価した。2分ごとに顕微鏡の下にサンプルを置き、観察する。ほとんど単一の細胞を検出できる場合は、FBSの5ミリリットルで反応を停止し、70ミクロンメッシュを介してフィルタし、その後、40ミクロンのメッシュを介して。
500倍Gで単一細胞を遠心分離し、摂氏25度で5分間休憩する。50ミリリットルの濃縮培地で再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて生存細胞数をカウントする。この開始細胞集団のうち2,000万個を2つの超低添付着器100ミリメートルペトリ皿のそれぞれに移し、摂氏37度、5%の二酸化炭素および21%酸素の組織培養インキュベーターでインキュベートする。
100ミリの組織培養皿当たりの残りの開始細胞集団の20〜2500万個の細胞を、濃縮培地の合計8ミリリットルの総体積でセデする。皿をインキュベーターに入れ、1.5時間後にセルトリ細胞の大部分がプレートに取り付けられていることを確認します。わずかに1つの新しい100ミリメートルプレートに上清を収集し、組み合わせて、インキュベーターに戻すために2つのプレートを傾けます。
1時間後、再び新しい100ミリメートルプレートに2つのプレートの上清を組み合わせます。プレートを一晩インキュベーターに戻します。次に、濃縮された生殖細胞を2つの分数、非接着分率およびわずかに付着分に集める。
非接着分率として上清を収集します。わずかに付着分率のためにPBSでプレートを穏やかに洗浄し、室温で5分間0.25%トリプシンEDTAの1〜20希釈の2ミリリットルで扱います。濃縮培地の2ミリリットルを加えることによって反応を停止し、非接着画分管に集める。
開始細胞製剤と濃縮された生殖細胞をチューブに組み合わせて、25%の生殖細胞を含む働く細胞製剤を得る。5分間摂氏25度で休憩を取るGの500倍の遠心分離機。上清を捨て、オルガノイド形成培地の20ミリリットルで細胞を再懸濁し、1ミリリットル当たり240万細胞の濃度に達する。
新しいチューブで細胞を含む溶液の1ミリリットルを追加します。マイクロウェルプレートの各ウェルに0.5ミリリットルの界面活性剤リンス溶液を加えます。気泡が井戸に閉じ込められないようにしてください。
気泡を2,000倍Gで遠心分離し、25°Cで25度のブレークを取り除きます。低倍率の逆顕微鏡でプレートを観察し、マイクロウェルから気泡が取り除かれたことを確認します。蓋でプレートを覆い、室温で30分間インキュベートします。
処理が完了したら、洗浄液を取り除き、すぐに滅菌水またはPBSでプレートを洗浄します。各ウェルにオルガノイド形成培地0.5ミリリットルを加え、2,000倍のGで遠心分離機を25°Cで2分間休憩して閉じ込められた気泡を取り除きます。低倍率反転顕微鏡で井戸を観察し、気泡が取り除かれたことを確認します。
働く細胞の懸濁液の0.5ミリリットルを加え、上下にピペットを入れ、穏やかに混ぜます。5分間摂氏25度で休憩を取るGの500倍の遠心分離機。反転顕微鏡を使用して、細胞がマイクロウェル内にクラスター化されていることを確認します。
5日間、細胞培養インキュベーターおよび培養物にプレートを移します。1 日おきにメディアの半分を変更します。オルガノイドを回復するには、広口ピペットを使用して、培地を上下に穏やかにピペットします。
これにより、オルガノイドはマイクロウェルから出てくる。オルガノイドを収集し、ゲルム細胞マーカー、セルトリ細胞マーカー、垂管状筋膜細胞マーカーおよびライディッヒ細胞マーカーの免疫細胞化学を修正し、実行し、共焦点顕微鏡下で視覚化する。本研究では、1週間齢のブタ精巣から細胞を単離し、自己組織化されたマイクロウェルで自己組織化し、明確な外装および内部コンパートメントを備えたスフェロイドに培養した。
2つの区画をコラーゲンIV陽性の前膜によって分離した。GATA4陽性セルトリ細胞およびUCHL1陽性胚芽細胞は、基基膜上の外室に入っていた。aSMA陽性の管状下膜状細胞は、CYP450陽性のライディッヒ細胞が間型の中心にあった間に、膜内に沿って局在した。
この構造は、ライディッヒ細胞、管状骨状ミオイド細胞が間質に位置するSitu条件に類似しており、間質コンパートメントおよび胚芽細胞において、セルトリ細胞は半日本体上皮に位置する。オルガノイドを生成するために使用されている細胞が最適な品質を持っていることを確認することが重要です。酵素消化のトリプシン化段階では注意が必要です。
この手順に従って、オルガノイドは、胚細胞分化を研究したり、遺伝子発現および分泌タンパク質またはホルモンについて分析するために長期間培養することができる。精巣特異的細胞の関連を持つオルガノイドを作成する能力は、精巣の発達と生殖細胞機能に重要な細胞間相互作用を研究する新しいインビトロシステムを提供する。
