核と細胞質の間で高分子の輸送を調査する技術を開発し、腫瘍抑制タンパク質の誤局在化を特定することは、CLLの病因の深い理解を得て、新しい治療法の開発を助けるために不可欠です。このプロトコルは、原発CLL細胞から核分画および細胞質分画を生成するための迅速かつ効率的な方法を提供する。これらの画分は、酵素活性アッセイ、プロテオーム解析、ウェスタンブロッティングを含む下流の実験で使用することができます。
この技術は、腫瘍内の治療法および微小環境シグナルが、CLL細胞および潜在的に他のB細胞悪性腫瘍における核と細胞質の間のタンパク質の閉じ込めをどのように変化させるかについての我々の理解を広げる。この方法は、タンパク質の位置を決定したり、必要に応じてタンパク質の動きを引き付けるために使用することができます。使用する予定の各セルラインに洗剤勾配を適用して、高度に富んだ核および細胞質画分の最適な生成を確実にします。
ジョディ・ヘイとマイケル・モレスと並んで、この手順を実証することは、私の研究室の技術者ジェニファー・カッセルズです。以前に同意した慢性リンパ性白血病患者から、白血球数を伴うEDTA採血管で末梢血サンプルを取得する。ヒトの血液サンプルは、血液媒介ウイルスを含む可能性があるため、危険とみなされるべきです。
これらのサンプルはクラス2のバイオセーフティキャビネットで取り扱い、ユーザーは常にラボコートと手袋を着用していることを確認してください。消毒剤中の血液汚染物質を処分する。白い細胞数が1ミリリットル当たり4000万個以上の場合は、RT CLL洗浄バッファで1対1の比率でサンプルを希釈します。
次に、アリコートRT密度勾配媒体をサンプル用の適切なサイズの円錐遠心管に入れた。サンプルを慎重に培地の上に、遠心分離機を400 x gでRTで30分間重ねます。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、CLL洗浄バッファーの密度勾配媒体の界面で収集した単核細胞の白層を穏やかに収穫する。この単層を新鮮な50ミリリットル円錐形遠心分離管に移します。
細胞を洗浄するには、この単層に40ミリリットルのCLL洗浄バッファーを加え、遠心分離機を室温で10分間300 x gで加えます。上清を捨て、チューブの底面をフリックしてペレットを再中断し、この洗浄を繰り返します。上清を捨て、チューブの底部を再度フリックし、ペレットの大きさに応じてCLL洗浄バッファのセットボリュームで細胞ペレットを再中断します。
細胞を数えた後、細胞の純度を確認するために細胞をフローサイトメトリーに計った後、刺激または薬物治療の準備ができて必要な細胞密度で組織培養プレートに細胞を入れる。刺激および/または薬物治療の後、インキュベーションは完了した。セルを摂氏4度で5分間200 x gの遠心分離機でそれぞれ標識された1.5ミリリットルマイクロフュージチューブとペレットに移します。
上清を捨て、ホスファターゼ阻害剤を用いて氷冷PBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。摂氏4度で5分間200 x gで遠心分離機。上清を取り除き、これらの細胞全体の抽出ペレットを氷の上に保管して、さらなる準備をします。
細胞質分画を調製するには、細胞ペレットを1x高トニックバッファーの 50 マイクロリットルに静かに再中断します。細胞が膨らむのを許すために、氷の上で15分間インキュベートする。特定の細胞タイプに使用する洗剤の最適濃度を決定するために洗剤勾配を行った後、各サンプルに0.8〜2.5マイクロリットルの洗剤を加え、最高の設定で渦を10秒間加えます。
細胞のリシスを確認するには、洗浄剤を添加する前後の位相コントラスト顕微鏡で細胞を観察します。すべての細胞は、明るいハローとして現れる細胞質に囲まれた密で暗い核を有する。一度lysed, 摂氏4度で30秒間14,000 x gでサンプルを遠心分離します。
慎重に、ペレットを乱すことなく、上清をあらかじめ冷蔵ラベル付きマイクロフュージチューブに移し、さらに分析するまでこの細胞質分率を摂氏80度で保存します。核分率の汚染を防ぐために、細胞質分画の完全な除去を確認してください。核分画を含む残りのペレットに、完全なリシスバッファーの50マイクロリットルを追加し、上下にピペットをピペットすることによって再中断します。
核膜に関連するタンパク質を可溶化するには、2.5マイクロリットルの洗剤を添加し、最高の設定に渦を10秒間加え、氷上で30分間インキュベートします。30秒間の最高の設定と遠心分離機の渦。その後、上清を事前に冷蔵標識されたマイクロフュージチューブに移し、さらに分析されるまでこの核分率を摂氏80度で保存します。
全細胞のライセートの場合、細胞全体の抽出ペレットを100マイクロリットルの完全なリシスバッファーに再中断し、上下にピペット処理します。完全な細胞のリシスを確実にするために、5マイクロリットルの洗剤を加え、氷の上で30分間インキュベートします。最高の設定で渦を30秒間、そして摂氏4度で20分間14,000 x gの遠心分離機。
上清を冷蔵マイクロフュージチューブに移し、さらに分析するまでこの全セルライセートを摂氏80度で保存します。核と細胞質の分画の間のタンパク質の密売を定量化するには、定量的にウェスタンブロット分析を行い、画像をインポートします。イメージリボンに画像を表示するには、[表示]グループの[選択]ボタンをクリックし、[ケミチャンネル]をクリックします。
[表示を選択]ダイアログが開き、必要に応じてさらに調整が可能になります。明るさやコントラストを含む画像 LUT のタブで調整可能なスライダーを使用して、追加の機能強化を実装します。微調整を行うには、[カーブ]タブを使用します。
データ分析の場合は、まず [解析] リボンをクリックします。1 つのチャンネルのみを分析するには、チャンネルの「チャンネルを表示しない」サムネイルをクリックして、分析していないチャンネルの選択を解除し、目的のチャンネルのみを表示します。信号の強度を定量化するには、[長方形の追加] をクリックして、画像に長方形を追加します。
タンパク質バンドなどのフィーチャの中心をクリックして、周囲に長方形を配置します。目的のシェイプを追加した後、[選択]をクリックして、カーソルを選択ツールに戻します。バックグラウンド ノイズを減算するには、[背景] グループの最初のボタンをクリックし、ドロップダウン メニューから [中央値] を選択します。
[背景]ダイアログで枠線の幅を 3 に設定し、背景計算に使用する画像背景を最も適したセグメントを選択します。データをエクスポートするには、表の上にある [図形] タブをクリックします。密度測定では、シグナル列の値が必要です。
シグナルは、図形のピクセルの強度値または合計から、その領域内の背景の積を引いた値の合計です。次に、[レポート] ボタンをクリックし、[名前を付けて保存] または [スプレッドシートの起動] をクリックします。保存されたスプレッドシート内の各プレーンまたは変数の対象となるタンパク質の正規化された発現を計算するには、目的のタンパク質に対して得られたシグナルを、対応するタンパク質負荷制御バンドのシグナルで割ります。
イメージをエクスポートするには、表の上にある [イメージ] タブをクリックし、エクスポートするイメージをクリックします。スライド プレゼンテーションなどのデジタル形式でイメージを使用する場合は、ソフトウェア アイコンをクリックし、[エクスポート] にカーソルを合わせ、[デジタル メディアのイメージ] をクリックして、必要に応じてイメージを保存します。密度遠心分離を用いて、1ミリリットル当たり4000万を超えるWCCを有するCLL細胞の濃縮は、高い細胞回収を可能にする。
FSCおよびSSC上での測定後のフローサイトメトリーによるサンプルの分析は、CLL細胞マーカー、CD19およびCD5の二重表面発現によって示されるようにCLL細胞の純度が95%以上であることを明らかにした。CLL細胞株、Mac-1、および一次CLL細胞の結果の分画に対して免疫ブロットを行った場合、分画は、一次CLL細胞の1〜30に比べて、Mac-1細胞の最適な洗剤レベルが1〜60希釈であることを示した。核および細胞質画分におけるFOXO1の細胞内局在化がMac-1および一次CLL細胞で決定された場合、細胞質画分における核およびベータチューブリンにおけるラミンのほぼ排他的な発現によって、高度に富んだ分画の生成が示された。
FOXO1発現は、AZD 8055による処理後の細胞質において減少し、NDCと比較して、核コンパートメントにおけるFOXO1発現の増加を伴い、タンパク質転位を示す。5つの主要CLLサンプルからの個々の免疫ブロットを細胞内分画内で定量した後、AZD 8055は細胞質におけるFOXO1発現のレベルを低下させ、核内の発現を増加させることが判明した。BCR架橋増加細胞質FOXO1発現.
タンパク質の分解を防ぐために、すべての試薬とサンプルを氷の上に保管してください。この手順で生成された細胞内分画は、FOXO1の細胞位置とそのDNA結合活性との間に平行に描かれるようにしたFOXO活性アッセイなどの酵素活性アッセイにも使用することができる。この技術の開発により、選択的阻害剤に応答してCLL細胞内の特定のタンパク質の密売に対処し、堅牢で定量化可能なデータセットを生成するための並列免疫蛍光研究を支援しました。
