このプロトコルは、アノフェレスガンビア蚊のトランスクリプトデータが1か所で自由かつ簡単にアクセス可能になったのは初めてであるため、重要です。この技術は、バイオインフォマティクスの背景を持たない研究者でさえ、好きな遺伝子や殺虫剤耐性蚊の発現データに自由かつ簡単にアクセスすることを可能にします。まず、LSTM IR-TEx プロジェクト ページの下部にあるリンクをクリックして、Ir-Tex Web アプリケーションを Web ブラウザで実行します。
Web ページが初期化されたら、ページの上部にある [アプリケーション] ボタンをクリックすると、アプリケーションと関連する出力が表示されます。[トランスクリプト ID] ボックスの既定のエントリに関連する各出力を読み取ります。ピレスロイド殺虫剤に曝露される条件およびアノフェレスコルジィデータセット、または0.98を超える相関係数を持つ任意の殺虫剤クラスおよび関連するトランスクリプトに曝露されない条件およびアノフェレスコルジイデータセットを選択します。
関心のあるトランスクリプトの発現を探索するには、まずトランスクリプトを選択します。次に、トランスクリプトIDをトランスクリプトIDボックスに入力し、対象のアイソフォームに依存してトランスクリプトがRXで終わることを覚えておきます。露出状況、対象の種、対象の殺虫剤クラスなど、各国の関連ボックスを取って尋問するデータセットを選択します。
これらの基準により、1 つ以上のデータ・セットが含まれるようにしてください。選択メニューの下部にある「ビューを更新」をクリックするか、または「戻る」を押します。アプリケーションの更新時間を指定します。
最初のグラフは、耐性集団と、選択された基準を満たす各データセット全体で、関心のあるトランスクリプトのラボの影響を受けやすい蚊集団の間のLog2折りたたみ変化を有する。関連調整済み P 値に加えて、関連する各データセットの耐性蚊と影響を受けやすい蚊の間の折りたたみ変化として、グラフの下の情報をお読みください。各行は、マイクロアレイ上の個々のプローブを表します。
対象のトランスクリプトが有意な実験の数、および選択した基準に一致する実験の合計数については、以下の表をご覧ください。タブ区切りの形式でデータをダウンロードするには、2 つの表の下にある [ダウンロード] ボタンをクリックします。これにより、ユーザーは Excel などのプログラムを使用して、データを簡単に探索できます。
地図上の各点は、関心のあるトランスクリプトが差で表現される各データセットにおける耐性蚊のおおよその収集サイトを表します。色は、アプリで説明されている信号システムに従います。グラフィック出力を保存するには、右クリックして[名前を付けて画像を保存]をクリックし、適切なフォルダを選択します。
アプリケーションによる出力エラーのインスタンスでは、入力された基準に一致するデータ・セットがない可能性があります。複数のデータセットにわたるトランスクリプトの発現パターンの相関を使用して、トランスクリプト関数を予測し、同じ経路から共に調整されたトランスクリプトを解明する可能性があります。[ビューの更新] をクリックする前に、絶対相関値スライダを 0.85 に移動し、[ビューの更新] をクリックするか、Return キーを押します。
相関テーブルを調べて、現在表示され、入力されたトランスクリプトとトランスクリプトと相関している複数のトランスクリプトを見つけます。各トランスクリプトの相関値を含むグラフィカル出力の下の表を読んでください。タブ区切りの形式でデータをダウンロードするには、[ダウンロード] ボタンをクリックします。
絶対相関値スライダーを操作し、最下部のグラフと表の変化を観察します。相関値のストリンジェンシーが低いほど、より多くのトランスクリプトが表示されますが、ノイズが増えます。IR-TEx がインストールされたら、RStudio 補足コーディング File1 を開き、各行を実行して、IR-TEx 用のシステムをセットアップします。
すべてのパッケージが正常にインストールされ、必要に応じて更新されたら、[ファイル]、[開く] に移動します。IR_TExを見つけます。r、ハイライトして開きます。
これで、RStudio の上部ウィンドウに表示されます。アプリを実行するには、ウィンドウの右上にある [アプリの実行] ボタンを押します。アプリが読み込まれる 2 つ目のウィンドウがポップアップ表示されます。
読み込みが完了したら、すべての機能を使用するために、ロードされたウィンドウの右上にある[ブラウザで開く]をクリックします。ユーザーは、TEx プロトコルで説明されているように、Anopheles Gambiae 15k Agilent アレイを使用して生成された IR-TEx に新しい抵抗データ セットを追加できます。追加ファイル2.txtを開きます。
このRNAシークファイルは、新しいデータの基になるテンプレートを表します。列 A は識別子、列 B は未処理の折り目変更、列 C は調整された P 値です。プラットフォーム間で識別子を 1 つのタブ区切りファイルに一致させる R コードを実行し、データを整理して正規化します。
命令はファイル内に含まれています。ファイルパスは、Mac OS の場合はスラッシュまたは Windows の場合はダブルスラッシュで区切られます。元のファイルをバックアップします。
補足コーティング File2 の最後に生成されたファイルを、次のステップで使用する場所に出力します。補足コーディング File2 は新しいFold_Changesを出力します。txt ファイル。
補足コーディングファイル3に含まれるコードを実行します。FC_DistribPlot という名前の出力ファイルを探します。ファイル パスとして指定されたフォルダー内の png。
Log2 折りたたみ変更の分布をチェックして、Log2 折り畳み変更の分散がデータ セット間でほぼ同一であることを確認します。ここに示されているのは、コートジボワールとブルキナファソの2つの多耐性アノフェレス・コルッツィイ集団におけるGS TMS1およびAGAP 009110 RAのmRNA発現である。ラボの影響を受けやすいアノフェレス・コルジイN-Guzoとの比較は、これらのトランスクリプトが2つの別々の多耐性集団で有意にアップレギュレートされていることを明らかにした。
RNA-I誘発ノックダウンは、LSTM実験室T-オシレコロニーからの蚊に対して行われた。このコロニーはコートジボワールに由来し、公衆衛生に使用されるすべての主要なクラスの殺虫剤に耐性があります。GS TMS1の発現の減衰は、デルタ・マセラン暴露後、GFP注入対照と比較して死亡率の有意な増加をもたらし、ピレスロイド耐性におけるこの転写産物の重要性を示した。
逆に、AGAP 009110 RAノックダウンは、曝露後の死亡率に有意な変化をもたらさなかった。GST MS1は、これらの種で利用可能な21のマイクロアレイデータセットのうち20個で有意に過剰に発現した。各場所では、フォールド変化は、感受性の高い集団と比較して、耐性において有意に高かった。
すべてのデータセットは、長年にわたって異なる実験から取得され、クリーンなマイクロ分析ベースのアプローチ用に設計されていないので、通常のP値ストリンジェンシーを下げる必要があるかもしれません。さらに、フェノチピックノックダウン評価は、他の殺虫剤、および生命史特性と共に行うことができる。十分に良好に見える結果がある場合、下流寄生はタンパク質の役割を決定することができます。
この技術は、アノフェレスガンビア種複合体の殺虫剤耐性に関するトランスクリプトデータを統合し、この分野のすべての研究者が利用できるようにする最初のアプリケーションです。
