プラスミドは、細胞間および集団間を移動することができるので、横遺伝子導入の非常に重要な薬剤であるほとんどの細菌種および生息地でユビキタスである染色体外要素である。このような転移の最も顕著かつ顕著な例の1つは、プラスミドにコードされる抗生物質耐性遺伝子の普及である。抗生物質耐性遺伝子をコードするプラズミドを構築するには、プラスミド骨格を選択し、プラスミドテンプレート上に結合する高忠実度ポリメラーゼおよびプライマーを使用して骨格を増幅します。我々の場合、pBBR1プラスミド骨格を使用した。次に、高忠実度ポリメラーゼを用いて天然Tn5プロモーターを含む抵抗性遺伝子nptIIを増幅する。プラスミド骨格に約20塩基対の配列相補性を有する耐性遺伝子用プライマーを設計する。PCR後、精製耐性遺伝子PCR産物の相同性領域を、50度で50度の等温アセンブリを用いて精製されたプラスミド骨格に60分間融合する。エレクトロポレーションを使用して、融合した製品を大腸菌DH5-アルファに変換します。選択培地上の混合物のプレート100マイクロリットルを、約24時間37度でインキュベートする。プラスミドは、抽出、検証し、大腸菌野生型株MG1655に変換することができます。これは、抗生物質暴露中に株MG1655 pCONを生み出し、細菌は生き残るためにプラスミドを必要とします。したがって、プラスミドは正の選択の下にある。非選択的な条件下では、抗生物質を使用しない場合、プラスミドは細胞に使い捨て可能である。我々の研究の目的は、時間の経過とともにこのような非選択的条件下でプラスミドに従う事であった。この目的のために、我々は抗生物質耐性遺伝子を持つ小さなプラスミドを装備し、大腸菌にそれを導入しました。我々は、進化実験を行い、レプリカめっきを介してプラスミド周波数を監視した。株mg1655 pCONを運ぶプラスミドは、進化実験に導入されました。まず、抗生物質を補ったLB寒天プレート上のプレートmg1655 pCONをプレートし、37度で一晩インキュベートする。このプレートから8祖先コロニーをランダムに選択し、一定の揺れで37度で一晩インキュベートします。翌日、集団は96の深い井戸プレートで行われる実験に移されます。プレート全体に複製物をランダムに分散することが非常に重要です。たとえば、チェッカーボードのアプローチです。我々の実験では、培養物は希釈され、異なる希釈速度と2つの温度で移動する。すべての転送イベントの間に希釈処理が適用され、連続転送は98の転送の合計にわたって繰り返される。進化実験に沿って、集団中のプラスミドの頻度は、細胞を運ぶプラスミドの割合から推定される。レプリカメッキは、1950年代にエステルとジョシュア・レダーバーグによって普及し、細菌中の薬剤耐性を研究するために使用されました。この方法は、彼らがフェノタイプのための彼らのスキャンを高級化することを可能にし、研究の終わりにペニシリン耐性はゲノムの自発的な突然変異のために細菌で起こり得ることを明らかにした。実験中に集団中のプラスミド頻度を決定するために、静止培養物は、非選択的LB寒天プレート上で逐次希釈およびメッキされる。プレートあたり250〜500コロニーの収率に従って希釈を調整します。めっきされた集団は、24時間未満の37度で一晩の成長のためにインキュベートされる。コロニーは、まだ小さいときに複製するのが最善です。一晩の成長の後、読者の選択の自動化されたコロニーカウンターを使用してすべてのコロニーを数えます。これは、培養における総細菌集団サイズをもたらす。プレートの端にあるコロニーは除外する必要があることに注意してください。プレートを複製するには、抗生物質、丸いブロック、ブロックにフィットする金属リング、無菌ベルベットの布を補った選択的寒天プレートが必要です。これは、オートクレーブによって滅菌することができるので、布は100%コットンである必要があります。布をブロックに置き、金属リングで固定します。慎重に固定ベルベット布の表面にカウントされたコロニーとプレートを置きます。すべてのプレート表面が布に触れるように、円の動きでプレートをタップします。すべてのコロニーがベルベットに触れることが非常に重要です。LBプレートを取り外し、ベルベットの上にセレクティブプレートを置きます。慎重なタップを繰り返します。プレートがベルベットに完全に触れるということが再び重要です。その後、選択プレートを取り外します。プレートは室温で一晩インキュベートされます。翌日、LBと抗生物質プレートの両方が評価に必要です。プレートを互いに上に置き、成長を比較します。コロニーのないスペースを簡単に見つけることができます。これらは、抗生物質に耐性ではないコロニーです。したがって、これらのコロニーはプラスミドを失った。最後に、抗生物質プレートに欠けているコロニーの数をマークします。この数字はあなたにプラスミドの損失を与えます。毎週の進化実験中に、すべての集団のレプリカめっきを繰り返します。プラスミド損失は、プラスミド多発奇形によって引き起こされる可能性がある。プラスミド構築に取り組むとき、あなたの好ましい宿主株における所定の遺伝子の発現について言う状態が取ることができる確認に関して生体内のプラスミドのネイティブな行動は、通常見落とされているものです。しかし、進化的な文脈では、このような変化の確認は非常に重要かもしれません。プラスミド確認の分析は非常にトリッキーな努力になる可能性があります。特にプラスミドマルチマーはPCRやシーケンシングによって正しく識別できないため、分析が困難です。一方、プラスミドマルチマーは、大きなサイズと低速の電気泳動移動性のためにゲル電気泳動による分析が困難です。私たちのプロトコルは、私が任意の与えられたプラスミド製剤と言うだろうでプラスミド多量体のスクリーニングと同定のための簡単で簡単な方法を提供しています。プラスミド分子を視覚にアルカリ性のリシスを用いて5mL定常一晩細胞培養からプラスミドを抽出する。低コピープラスミドのプラスミド抽出は、しばしばビジュアライゼーションの前に消化する必要がある宿主染色体DNAとの汚染につながる。染色体DNA汚染を除去するために、抽出したプラスミドDNAをプラスミドセーフで処理
