現在利用可能な生化学的アプローチを用いた細胞表面相互作用の検出は、依然として技術的な課題を抱えています。このプロトコルは、ゲノムスケール細胞スクリーニングアプローチを用いて、細胞表面における受容体リガンド相互作用を同定する遺伝的代替手段を提供する。他のほとんどの既存の方法とは異なり、この方法は受容体の生物学に関する仮定をしません。
それは細胞表面の分子の広い範囲によって媒介される相互作用を識別する機会を提供する。細胞表面分子はモノクローナル抗体などの薬物に直接アクセスできます。したがって、これらの分子によって媒介される相互作用の同定は、重要な治療上の意味を持つことができる。
この方法は、一般に、細胞シグナル伝達および認識プロセスの探索に関心のある研究者に適用可能であり、神経および免疫学的相互作用および宿主病原体相互作用を含む幅広い生物学的文脈にある。このプロトコルには、高スループットのセルソートマシンと次世代シーケンシングマシンが必要です。プロトコルを開始する前に、これらの機能が使用可能であることを確認してください。
96ウェルプレートにビオチン化タンパク質サンプルの8つの連続希釈を行い、各希釈液の最終体積が少なくとも200マイクロリットルであり、タグのみのコントロールが含まれていることを確認します。各ウェルから100マイクロリットルを取り除き、新しい96ウェルプレートに移すことによって、サンプルの複製プレートを作ります。すべての結合エッセイに制御プローブとして使用されるタグのみのタンパク質制御を含む。
1つのプレートのウェルに0.1マイクログラム/ミリリットルレンサビジン-PEを100マイクロリットル、もう一方のプレートのウェルに希釈バッファー100マイクロリットルを加えます。プレートを室温で20分間インキュベートします。一方、希釈バッファーでストレプトアビジンコードプレートのウェルを15分間ブロックします。
プレートを洗った後、乾燥していることを確認してください。次に、サンプルの総体積を両方のプレートからストレプトアビジンコードプレートの個々のウェルに移し、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、200マイクロリットルの洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。
マウスアンチラットCd4d3 +4 IgGの100マイクロリットルを追加し、さらに1時間プレートをインキュベートします。を繰り返します。抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲートの100マイクロリットルを追加し、室温で1時間プレートを残します。
その後、洗浄バッファーでウェルを 3 回、希釈バッファーで 1 回洗います。p-ニトロフェニルリン酸を色素エタノールアミンバッファーで1ミリリットルあたり1ミリグラムで調製し、各ウェルに100マイクロリットルを加えます。15分間のインキュベーションの後、吸光度を測定し、各ウェルを405ナノメートルで持っています。
プレート上に信号がない最小希釈を、四面子を作成するための適切な希釈係数として使用します。インキュベートストレプトアビジン-PEと適切なビオチン化タンパク質希釈を室温で30分間用いた。その後、コンジュゲートタンパク質を光保護チューブに4°Cで保存し、さらに使用します。
処理された円錐管を200回Gで5分間回転させます。上清を取り除き、後で使用するためにマイナス20°Cでチューブの1つを凍結します。他のチューブのペレットを1%BSAのPBSの10ミリリットルで再懸濁し、96ウェルプレート上の陰性対照として100マイクロリットルの細胞を確保する。
次に、コンジュゲートされた組換えタンパク質を円錐チューブおよび96ウェルプレートの細胞懸濁液に加えます。緩やかな回転を伴うベンチトップローターで、4°Cで少なくとも1時間セル染色を行います。その後、細胞をGの200倍に5分間ペレットし、上清を除去する。
細胞を2回洗浄した後、5ミリリットルのPBSで再懸濁する。30マイクロメートルのストレーナーを通して細胞をひずんで細胞クラスターを取り除く。次に、フロー臭でそれらを分析します。
BFP 陽性細胞と PE 陰細胞のゲートには、陰性コントロール サンプルを使用します。その後、サンプルをソートし、500、000〜100万BFP陽性およびPE陰性細胞を1.5ミリリットル遠心チューブに集めます。痛みケージは、タンパク質への細胞の結合に依存しますが、通常、PE陰性サンプルの1〜5%が収集されます。
次に、5分間Gの500倍の遠心分離機で選別した細胞を、慎重に上清を取り除きます。ペレットは、マイナス20°Cで最大6ヶ月間保存することができます。マジックの count 関数を使用して、並べ替えされていない、並べ替えられた母集団のシーケンスを参照ライブラリにマップし、生のカウント ファイルを生成します。
コントロールとして未ソートコントロールサンプルからの生のカウントと処理としてソートされたサンプルからのカウントを使用して魔法のテスト関数を実行します。生成された遺伝子サマリーファイルを開き、ポーズランク列を昇順でランク付けします。次に、誤検出率がポイント 0.05 未満のヒットを特定します。
受容体は、通常、最初の位置で非常に頻繁にランク付けされます.最後に、R または同等のソフトウェアを使用して、正の選択のための堅牢なランク付けアルゴリズム スコアをプロットします。ヒトTNFSF9およびヒトTNFSF9およびPのファルシパームまたはH5の結合パートナーの同定のためのゲノムスケールノックダウンスクリーンは、NCI-SNU-1およびHEC-293細胞でそれぞれ行った。
Rh5の結合挙動は、ヘパラン硫酸の両方の影響を受け、TN-FRSF-9は既知の受容体TN-FSF-9との結合を失わなかったのに対し、BSG受容体は公知であった。可溶性ヘパリンによるインキュベーションの際.制御変異体ライブラリーにおけるGNA分布により、ライブラリーの複雑さは実験の過程を通じて維持されていたことが明らかになった。
スクリーンの技術的品質は、必須遺伝子の基準セットの分布と比較して、G-RNAの標的化の観察された折り畳み変化の分布を調べることによって評価された。さらに、経路レベルの濃縮は、期待される必須経路が同定され、中退集団において有意に豊かであることを明らかにした。対照試料を元のプラスミドライブラリーと比較した場合。
堅牢なランクアルゴリズムまたはRRAスコアは、G-RNAが予想よりも一貫して高くランク付けされている尺度を提供します。TNFRSF9 の画面で、最もヒットしたのは、既知のバインディング パートナーである TNFSF9 でした。また、TP53経路に関連する多数の遺伝子も同定された。
RH5の場合、既知の受容体に加えて、硫酸化されたギャグの産生に必要な遺伝子と、SLC16A1遺伝子も同定された。スクリーニングアプローチは通常非常に堅牢であり、直接相互作用する受容体は、この集団の順序で濃縮された遺伝子のリストに高度にランク付けされるべきである。画面から得られたヒットを検証することが重要です。
相互作用がタンパク質によって媒介される場合、例えば、バイナリタンパク質タンパク質相互作用を研究するために設計された生化学的アプローチは、さらなる検証研究に使用することができる。このアプローチの非バイアスのゲノムスケールの性質から、脂質、マルチパス膜タンパク質、グリカンなどの細胞分子の研究が困難な相互作用を探求するのに役立つことを期待しています。また、受容体の密売や生物学に必要な新しい経路を明らかにすることができます。.
