増加する証拠は、生理学の大腸部にエストロゲンシグナル伝達の影響を示唆し、免疫組織化学は結腸内のエストロゲン受容体を同定するための有望な技術であり、大腸炎に進化する。我々は、免疫蛍光を用いて、結腸内のエストロゲン受容体の免疫物質化学的可視化のための完全かつ検証されたプロトコルを提示する。ウッチ大学顕微鏡イメージング研究室のシルウィア・ミケレスカ博士と共に、この手順をデモンストレーションします。
ペトリ皿にコロンを入れます。コロンを1~2センチの断片に切ります。適切にラベル付けされた組織学的カセットにスポンジの上に各断片を置きます。
4%パラホルムアルデヒドにコロン断片を含むカセットを入れる。摂氏4度で少なくとも24時間インキュベートする。50%70%90%95%および100%エタノール、キシレン100%エタノール、キシレンのみ、および液体パラフィン中のインキュベーションの少なくとも3時間のインキュベーションのためのインキュベーションの1時間のためにティッシュプロセッサを準備し、プログラムします。
コロンフラグメントを組織学的な箱に移します。事前にプログラムされたティッシュプロセッサに箱を置き、プロセッサを実行します。組織プロセッサでインキュベーションした後、組織学的ボックスからコロンを取り出し、結腸の両端が直立位置になるように、結腸片を金属型に入れる。
金型の3分の1を流動パラフィンで満たします。金型をマイナス5度の摂氏(マイナス5度)に数秒間置き、金型を摂氏70度で温暖化領域に移動します。その後、組織学的な箱の下部にカビを置き、液体パラフィンで全体の結腸断片をカバーします。
結腸片とパラフィンを含む金属鋳型を冷却領域に数分間置きます。その後、結腸とパラフィンブロックから金属モールドを取り除きます。結腸とパラフィンブロックを摂氏4度で少なくとも24時間インキュベートする。
インキュベーション後、ブロックから余分なパラフィンを取り除きます。コロンとパラフィンブロックを完全に自動化されたロータリーミクロトームに挿入します。結腸の断片を5マイクロメートルのセクションに切ります。
1つのコロンセクションを水浴に移し、摂氏40度に予熱します。ラベル付きガラススライドを使用して、水浴からコロン部を取り除き、ガラススライドを室温で24時間インキュベートします。まず、ガラススライドをキシレンで5分間インキュベートしてパラフィンを取り出します。
この手順を 3 回繰り返します。その後、ガラススライドをキシレンと100%エタノールの1対1の混合物に5分間置きます。この手順を 3 回繰り返します。
一連の減少エタノール濃度を使用して、結腸セクションを水分補給する。スライドをエタノールに5分間浸します。次の濃度に進む前に、各濃度で3回繰り返します。
ガラスのスライドを流水の下で5分間すすぐります。抗原の取得バッファーを 95 ~ 98 °C に再加熱します。次に、沸騰抗原検索液中のガラススライドを10分間加熱します。
試薬の無駄を防ぐには、疎水性ペンを使って結腸部の周りに円を描きます。その後、ペルオキシダーゼ水素と水の3%溶液でスライドを10分間インキュベートします。洗濯液でスライドを5分間洗います。
次に、スライドを室温で1時間ブロッキング溶液にインキュベートします。ブロッキング溶液を取り除き、E-Rアルファ、E-Rベータ、またはG-P-E-R希釈に対して20〜50マイクロリットルの一次抗体を添加する。一次抗体を暗闇の中で摂氏4度で一晩インキュベートする。
抗体溶液を除去します。スライドを洗浄液で3回洗い、毎回5分間洗います。次に、希釈二次抗体を添加する。
暗い中で室温で1時間色素と共役した二次抗体でスライドをインキュベートします。スライドから二次抗体溶液を取り除きます。スライドを洗浄液で3回洗い、毎回5分間洗います。
薄めのフルオロクロムを加えて膜の可視化を行い、暗闇の中で室温で10分間インキュベートします。溶液を取り出し、スライドを洗浄液で3回洗浄し、毎回5分間洗います。細胞核の可視化のためのフルオロクロムであるグリセロールベースの液体DAPIを数滴追加し、直接コロンセクションに追加します。
カバースライドで注意深く覆ってください。コロンセクションを摂氏4度で少なくとも24時間インキュベートする。20xまたは63xの目的と油浸漬を特徴とする共焦点顕微鏡の下で結腸部を分析する。
研究で使用した抗体の特異性をMCF-7細胞を用いて検証した。エストロゲン受容体抗体は、核エストロゲン受容体E-R αおよびE-Rベータの検出を可能にしたとともに、膜結合エストロゲン受容体G-P-E-Rを有する。また、MCF-7細胞を、フルオロクロームとグリセロール系液体と結合した二次抗体とDAPIを結合した場合にのみ染色された陰性対照も行った。
E-R αの強い細胞質シグナルは、コントロールマウスおよびTNBS誘発クローン病のマウスから得られた結腸セクションで発見された。しかし、コントロールマウスから得られた結腸のみが、ゴブレット細胞質にE-Rαを局在化していた。共焦点顕微鏡はまた、コントロールおよびTNBS処理マウスの両方の大腸セクションにおけるE-Rベータの細胞質局在化を明らかにした。
同様に、G-P-E-Rの細胞質局在化は、コントロールマウスおよびTNBS処置マウスから得られた結腸セクションに文書化された。金型内のコロンの正しい位置は、正しい断面を生成するために不可欠です。フルオロクロムは、独自の励起および発光スペクトルによって選択されるべきである。
この方法は、大腸炎の発症に関与し得る他のタンパク質にも適用することができる。免疫蛍光による免疫体系化学検出は、タンパク質方向状態で他のタンパク質を染色するように拡張することができる。
