Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
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著者らは、この研究が補助金契約No.760813の下で、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムから資金を受け取っていることを認めたいと思います

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著者らは開示するものは何もない。

3D肝モデルの適用は、標的にされる特定の生化学的エンドポイントまたは有害な結果経路によってかなり異なる。各モデルには、一次ヒト肝細胞(PHH)モデルのドナー間変動から細胞系モデルにおけるチトクロームp450活性の低下まで、その利点と限界があるが、すべて独自の権利6、12、18、19において価値がある。遺伝毒性を評価する場合、モデルには、能動増殖が必要なため、インビトロ小核アッセイなどの規制承認エンドポイントとの適合性が制限される。遺伝子毒性評価は、DNA修復が一過性の病変を矯正する機会がある場合に細胞分裂後に評価される固定DNA損傷の定量化を必要とするため、これが必要である。残念なことに、高度に分化した肝細胞(すなわち、hepaRG)ベースのスフェロイドまたはPHHマイクロ組織は、最も生理学的に関連する肝臓様特性を示すものと考えられるが、これは静的(不増殖)モデル12、19、20を形成する。その結果、ここで提示される3D HepG2スフェロイドモデルは、遺伝毒性試験をサポートできる適切な代替モデルを提供します。HepG2細胞系スフェロイドは、アルブミンや尿素産生などの基本的な肝臓様特性を維持しながら、スフェロイドの外表面に十分な積極的に細胞を分割し、CYP450活性5、12、19を有する。このインビトロ肝モデルは、この小核アッセイを補完するために開発されており、これは、遺伝毒性試験8、10、11、21の電池で推奨される2つのインビトロアッセイのうちの1つである。しかし、このモデルはDNAシーケンシング解析および遺伝子発現(RNA)技術に容易に適用することができ、彗星アッセイのような他のDNA損傷エンドポイントにさらに適応して利用される可能性がある。しかし、一部のエンドポイント解析において、ENM干渉が果たす役割を考慮することが重要です。例えば、フローサイトメトリーベースの解析は、特に粒子干渉22によるENM遺伝子毒性評価には適さない場合がある。
細胞分裂を活発に行うスフェロイドモデルの制限要因の1つは、その大きさです。シード密度の最適化は、モデルが増殖し続ける十分なセルが必要であるため、重要です。しかし、あまりにも高い細胞数, スフェロイドが過度にコンパクトになる結果, 壊死コアの増加につながります.この壊死の原因は、酸素および栄養拡散を制限していると考えられており、この拡散の限界は、組織23、24の約100〜150μmであると考えられている。しかし、これは細胞型、細胞数、足場相互作用および培養条件25に依存する。以来、直径約700μmがC3Aスフェロイドの中心における壊死の早期発症を避けるための限界であることを示されており、スフェロイド当たり4000HepG2細胞を播種すると、露光時のモデルの直径が≤500μm26であることを保証する。さらに、Shah et al. は、ヘプG2細胞が球状体1個当たり5000細胞を超える播種が培養7日後に生存率の25%減少を示したことを確立した。これを克服するために、本プロトコルで考案されたモデルは、スフェロイドの初期形成に続いて、吊り下げ低下がアガロース被覆井戸に移される重要なステップを経る。これにより、スフェロイド内で増え続ける細胞数を維持するために、より多くの培養培地が存在することを保証する。その結果、HepG2スフェロイドモデルは培養で10日後に70%以上生存し続け、インビトロでの長期ハザード評価に利用することができる。
HepG2スフェロイドモデルは急性および長期の曝露レジーレジーをサポートできるが、培地の完全な置換がスフェロイドの潜在的な損失のために推奨されないとして、培養期間中の細胞培養培地のリフレッシュは、このモデルに対して制限される。ENM露光では、均質なENM分散液が凝集・沈殿する傾向が高いと推測されます。しかし、ENM堆積物が粒子パラメータ(例えば、大きさ、形状および密度)に応じて変化し得る速度は、IN体外沈下、拡散および線量測定(ISDD)モデル、またはその最近の誘導体を使用して理論的に決定できることが注目に値する。この心を用いて、細胞培養液の50%のみが細胞培養の表面から慎重に除去されれば、ENM用量の破壊およびその後の除去は理論的には最小限に抑えられるべきである。しかし、ブラウン運動が遊びで、これは厳密にはそうではないかもしれないし、テストされる各特定のENMの堆積および沈下へのさらなる作業は、長期的な暴露体制27を通じて正しい量体測定が保持されることを確実にするために行われるべきである。主に、これは最終的な蓄積された濃度に不可欠である可能性があり、繰り返し投ずる体制を実行する際に考慮すべき潜在的な制限です。一方、化学物質ベースの暴露は、考慮すべき独自の制限がないわけではないが、化学物質が溶液中に残る傾向があり、新たに添加された濃度に加えて元の化学物質濃度を直接交換するという点でより単純なアプローチを提供し、メディアリフレッシュ中に失われた化学物質をそれに応じて29に置き換えることを保証する。将来の応用には、特定の臓器系が異種生物物質の生物蓄積によって誘発される副作用を改善または克服する能力を評価するために、長期培養期間にわたる反復暴露体制に対するモデルの適合性を評価することが含まれる。
結論として、この3Dインビトロ肝モデルは、現実的な暴露シナリオの範囲を評価するために利用される能力を有し、それによってENMと化学的ハザード評価の両方をより良くサポートするための将来のインビトロアプローチをルーチンで容易にアクセス可能な方法で提供する。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

人間ベースのアプリケーション(食品、化粧品、衣料品、スポーツ用品、電子機器、輸送、医薬品など)を通じて、多様なエンジニアリングナノ材料(ENM)の急速な開発と実装により、人間が定期的にENMにさらされることは避けられません。これにより、これらの材料が多数の用途で有利であると考える新しいサイズ固有のフィジオ化学的特性が、人間の健康と環境に付随する悪影響を引き起こす可能性があるという懸念が高まっている。現在、多くの国際的な活動は、積極的にこれらのENMへのより生理学的に関連する暴露を反映し、急性、長期、および繰り返し低用量暴露シナリオにわたってこれらの材料の潜在的な毒性を評価するために実施されています。
肝毒性学は、ENM曝露を考慮する際に重要であり、肝臓が曝露後のENM蓄積の主要部位であることを広く知られている1,2。また、肝臓は全身循環に入る物質の代謝と解毒のための第一次臓器系である。2D肝細胞モデルは、複雑な多細胞相互作用の複雑さを正確に模倣しない、または生体内で観察される代謝活性を適切に表さないという受け入れられた理解に基づいて、生体内代替技術のための堅牢で生理学的に関連する3D肝モデルの開発に大きく焦点を当てて4,5が確立されている。高度な3D培養技術を利用することで、インビトロ肝モデルの寿命が向上し、長期にわたる反復暴露体制の調査が可能になります。さらに、この高度な培養フォーマットは、胆汁カナリキュリ、活性トランスポータープロセスおよび改良されたCYP450薬物代謝能力などの強化された生理学的、organotypicの特徴の形成を促進し、モデル6の予測性を向上させる。現在の3Dインビトロ肝モデルは、単一培養物(肝細胞のみ)または共培養(非パレンキサイト細胞を有する肝細胞)からなるいくつかの形式で存在し、 超低接着板のマイクロ組織またはスフェロイド、吊り下げドロップスフェロイド、マトリックスおよび/または足場および微小流体細胞培養プラットフォームに埋め込まれた細胞に及ぶ、それらのすべては、肝毒性評価6、7のための効果的な高度なインビトロモデルとみなされる。しかし、これらのモデルシステムの大半は、高いメンテナンス、特殊な機器を必要とし、高価です。さらに、これらのモデルは、固定DNA損傷を定量化する方法を用いた遺伝毒性試験などのハザードエンドポイントの評価における使用を妨げる静的(すなわち、非分割細胞モデル)であることが多い。遺伝毒性は、規制毒性学の中核的前提条件であり、任意の毒性物質のリスク評価の重要な構成要素である8.外因性物質への暴露後に生じる可能性のあるDNA損傷のすべての形態を定量化するために適用できる単一のアッセイはありません。しかし、インビトロ遺伝子毒性試験用電池のコア成分は、微小核アッセイであり、これは総染色体損傷9を測定する信頼性の高い多面的な技術である。これは、OECD試験ガイドライン487によって記述された金標準技術であり、インビトロDNA損傷および遺伝毒性を評価するための、および規制ハザード評価10、11のための試験電池要件の一部である。
ヒト肝細胞癌細胞株HepG2は、細胞が容易に入手可能であるように初期ハザード評価スクリーニングに広く使用され、比較的安価にソース化し、培養が容易で、高スループットスクリーニング12,13に適している。3D球形構造に培養した場合、それらは肝臓微小環境を良好に再現し、微小核アッセイ3を支持するのに十分な増殖能力を有する肝モデルを提供することが示されている。HepG2スフェロイドモデルのさらなる開発は、長期にわたる反復暴露体制(≤14日間)における遺伝毒性ハザード評価をサポートするために、モデルの長寿および肝臓様機能性を向上させるために確立された。したがって、動物実験を置き換え、低減、改良する3Rの原理に沿って、本プロトコルは、複数の毒物学的エンドポイント(例えば、肝臓機能、(炎症マーカー、細胞毒性および遺伝毒性)に続く、急性および反復的な化学的およびENM暴露を確実に評価することができる高度な3Dインビトロ肝モデルを提供するために確立された。
ここでは、急性または長期にわたるENM曝露後の遺伝毒性ハザード評価のためのインビトロモデルシステムに基づく生理的に関連する3D肝細胞細胞株を確立する方法を提示する。プロトコルは6つの重要な段階に分けることができます:凍結保存HepG2細胞を培養する。ヘプG2スフェロイド製剤;ヘプG2スフェロイド転写は、吊り下げからアガロース懸濁液へ。ヘプG2スフェロイド収穫;マイクロ核アッセイとスコアリング;データ分析を行います。

<table><tbody><tr><td>Aflotoxin B1</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG Albumin Assay</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Powder</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cell Freezing Aid</td><td>Thermo Fisher Scientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, UK</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Metal Clips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Filter Cards for Shandon Cytospin</td><td>FisherScientific, UK</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Glass Slides</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa&#039;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td><td>VWR Chemicals, UK</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips (24 x 60)</td><td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer and Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil for Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Class II Tissue Culture Hood</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Filtered, Sterile 200&amp;micro;l and 1000&amp;micro;l Pipette tips</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific, Denmark</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and P200 micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 and P50 multi-channel pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Free</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Buffer Tablets</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&quot; - Probe</td><td>Branson, USA</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>T-25 (690175) and T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Urea Assay Kit</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon Disinfectant</td><td>DuPont, UK</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath (37?C)</td><td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;micro;m Filter Unit</td><td>Millex HA, MF-Millipore, UK</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0mL Syringe</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, UK</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Germany</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37?C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL Pasteur Pipette</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Conical Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL or 100mL Glass Bottles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Skirted Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm Square, Petri Dish</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

多様なエンジニアリングナノ材料(ENM)の急速な開発と実装により、ENMへの暴露は避けられず、堅牢で予測的なインビトロ試験システムの開発が不可欠です。肝臓は代謝性恒常性および解毒に重要な役割を果たすだけでなく、ENM蓄積後の暴露の主要な部位であるため、肝臓毒性学はENM曝露を考慮する際に重要である。このことと、2D肝細胞モデルが生体内で観察される複雑な多細胞相互作用および代謝活性の複雑さを正確に模倣していないという理解に基づいて、生体外でのENMハザード評価目的に合わせた生理学的に関連する3D肝モデルの開発に大きな焦点が当てられています。動物実験を置き換え、低減、改良する3Rの原理に沿って、3D HepG2細胞株ベースの肝臓モデルが開発され、拡張および繰り返しENM暴露体制(≤14日)の両方をサポートできるユーザーフレンドリーで費用対効果の高いシステムです。これらのスフェロイドモデル(直径500μm≥)は、増殖能力(すなわち、細胞モデルの分割)を保持し、体外での遺伝毒性を効果的に評価するために「ゴールドスタンダード」マイクロ核アッセイと結合することができます。毒性学的エンドポイントの範囲(例えば、肝機能、(プロ)炎症反応、細胞毒性および遺伝毒性)の両方にわたっていくつかのEnMを使用して、急性(24時間)および長期(120時間)曝露療法を報告する能力が特徴付けられている。この3D in vitro肝モデルは、より現実的なENM暴露を評価するために利用される能力を有し、それによってENMハザード評価をより適切にサポートするための将来のin vitroアプローチを提供し、ルーチン的かつ容易にアクセス可能な方法でENMハザード評価を提供する。

この細胞系ベースの3D肝スフェロイドモデルの長期培養および遺伝毒性ハザード評価の適合性を、ベースライン特性評価を行い、培養中の14日間のモデルの生存率および肝臓様機能性および微小核アッセイに対するその適用性を決定することによって評価した。
3D HepG2肝臓回転楕円体モデルのベースライン特性 インビトロ毒物学的評価の前に、アガロース転移または化学/ENM処理を行う前に、3D HepG2スフェロイドが正しく形成されていることを確認することが重要です。吊り下げ液法を用いて製造されたHepG2スフェロイドは、通常、図5 A-5Cに示すように、平均直径495.52 μmのHを有するコンパクトな球形の球状スフェロイドを形成するのに2〜3日の播種後(4000細胞/スフェロイド)を要する。正しく形成され、体外毒性評価に使用できるHepG2スフェロイドは、滑らかな表面と視覚的な投影のないコンパクトな球形の構造を持っている必要があります。図 5に、品質の良さと品質の悪さ (図 5G-I)スフェロイドの例を示します。後者は破棄する必要があります。通常、プレートごとに形成されたスフェロイドの90〜95%が正しく形成され、さらなる実験のために実行可能である。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> 図5:吊り下げ液法を介して形成されたHepG2スフェロイドの自然形態を示す光顕微鏡画像。(A-C)ショー2日目と(D-I)4日目HepG2肝臓スフェロイドポストシード。(D-F) は良質 HepG2 スフェロイドの例であり、 (G-I) は形成不良のスフェロイドを示しています。すべての画像は、顕微鏡を使用してX20目的で撮影した。スケールバーは20 μmを表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">します</a>。
HepG2スフェロイド生存率をさらに確認するために、基本的な着色ブロモクレゾールグリーンアルブミン(BCG)アッセイまたはウレアアッセイを行い、肝臓様の機能性を評価することができる。肝臓様の機能性は、14日間の培養期間にわたってトリパンブルー排除アッセイを使用して生存率に沿って評価され、肝臓スフェロイドモデルの寿命を決定し、長期的または繰り返しENM/化学的ハザードアセスメントをサポートできるかどうかを確立した(図6)。アルブミン濃度は培養期間にわたって一貫した状態を保った。尿素生産は、7日目までに高原に到達する前に、培養で1週間にわたってスフェロイド当たりの尿素の濃度の増加を表示します。3D HepG2スフェロイドで産生されるアルブミンおよび尿素のレベルは、2D形式で培養された同じ細胞株で観察されたものよりも実質的に高い点に注意することが重要である。実際、HepG2細胞、ピークアルブミンおよび尿素レベルの2D培養は、それぞれ0.001mg/mLおよび0.010 ng/μLであった。さらに、ほぼ同一のHepG2スフェロイド系を用いてShahらが発表した以前の研究では、2D培養HepG2細胞5と比較した場合の3D HepG2インビトロモデル系における代謝活性(CYP1A1およびCYP1A2)の顕著な改善を強調した。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> 図6: HepG2肝スフェロイドの14日間ベースライン特性データ吊り下げからの移し換えの後、(A)は14日間にわたってHepG2スフェロイドモデルの生存率を強調し、(B)および(C)は肝臓のようなアルブミンおよび尿素の機能をそれぞれ強調する。SEM±提示された平均データ、n = 4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
壊死性コアの必然的な発達に伴い、3D肝スフェロイド培養の既知の限界であり、このHepG2ベースのモデルの生存率は、微小核アッセイ5を支持するために必要な増殖能力を維持しながら、長期(5〜10日)の暴露レジームを維持できることを実証するために確立されなければならなかった。実際、この3D肝スフェロイドモデルは、培養で10日間にわたって70%の生存率を保持することが示されています。このことから、≥14日間の培養期間に観察された持続的な肝臓様の機能と組み合わせて、この3D肝スフェロイドモデルは、10日間の長さ(すなわち、スフェロイドの生存率が70%を下回る前)の長期にわたる反復ENM曝露レジームをサポートすることができる。参考までに、4000細胞/スフェロイドに播種されたHepG2スフェロイドのアルブミンレベルは≥20.0 ng/μL で、尿素生産は≥0.25 ng/μLであるべきである。
工学ナノ材料の遺伝毒性評価 遺伝毒性評価のために、微小核アッセイを用いて、急性(24時間)および長期(120時間)の両方のENM曝露に続く小核の存在を決定した。アフラトキシンB1は、既知の肝発がん性物質16、17であり、小核アッセイに推奨される陽性対照である。最適化実験では、0.1 μMのアルファトキシンB1が3D HepG2肝スフェロイドにおいて有意な陽性(≥2.0倍の増加)の遺伝毒性応答を誘導し、このモデルで行われるすべての微小核アッセイに使用することが示されています。HepG2スフェロイドモデルを用いたマイクロ核アッセイ結果の有効性を保証するために、この3Dインビトロモデルで使用されるHepG2細胞のバックグラウンドマイクロ核周波数は0.6%~1.2%の範囲内にある必要があります。その結果、アルファトキシンB1は、陰性対照で見られるものよりも少なくとも2倍高い遺伝子毒性応答を誘導すべきである。したがって、0.1 μMのアルファトキシン B1 は、1.5% ~ 3.0% の間のマイクロ核周波数を誘導する必要があります。これらの制御パラメータを用いて、ENMに関連する遺伝子毒性インビトロを、確実に評価することができる。OECD試験ガイドライン487に基づいて、ENMまたは化学薬品を試験する際に、選択された濃度が5%以上±5%以上の細胞傷害性を誘発してはならないことに注意することが重要である(負の対照に関連してCPBIまたはRVCC値の低下によって示される)11。図7は、アフラトキシンB1および2つのENM(二酸化チタン(TiO2)およびスライバー(Ag))がHepG2スフェロイドにおける急性および長期曝露の両方に続いて評価された場合に生成されたデータを示し、その後の遺伝子毒性電位をミクロ核アッセイを用いて分析した。評価された両方のENMは、急性(24時間)暴露および長期(120時間)曝露体制に対する非細胞毒性、低用量5.00μg/mLで試験された。TiO2およびAg Enmsの両方にわたって遺伝毒性の同様の傾向が観察され、それによって24時間暴露後に生じた遺伝毒性応答の上昇は、長期5日間の暴露後に明らかではなかった。これは、両方の時点でアフラトキシンB1陽性対照によって誘導された持続的な遺伝毒性にもかかわらずであった。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> 図7: HepG2肝スフェロイドに対するTiO2およびAg ENM曝露に続く遺伝毒性評価微小核アッセイポスト(A)急性(24時間)および(B)を用いた遺伝毒性(微小核頻度)評価(A)および(B)TiO2およびAg ENMの5.00 μg/mLへの長期(120時間)曝露。ネガティブコントロールはメディアのみであり、正のコントロールはAflatoxin B1の0.1 μMです。平均データ(n=2)は、SD±提示され、負のコントロールに関連して示された有意性:* = p≤0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

この手順は、急性または長期の反復用量レジーム上のナノ物質暴露に関連する遺伝子毒性有害性のより生理学的に関連する評価を提供することができるインビトロで高度な3D肝培養物を開発するために使用されるように確立された。

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K ビュー.  Swansea University Medical School. この手順は、急性または長期の反復用量レジーム上のナノ物質暴露に関連する遺伝子毒性有害性のより生理学的に関連する評価を提供することができるインビトロで高度な3D肝培養物を開発するために使用されるように確立された。

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Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

がん研究

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a fibrotic environment actively supporting and driving hepatocarcinogenesis. Insight into hepatocarcinogenesis in terms of the interplay between the tumor stroma micro-environment and tumor cells is thus of considerable importance. Three-dimensional (3D) cell culture models are proposed as the missing link between current in vitro 2D cell culture models and in vivo animal models. Our aim was to design a novel 3D biomimetic HCC model with accompanying fibrotic stromal compartment and vasculature. Physiologically relevant hydrogels such as collagen and fibrinogen were incorporated to mimic the bio-physical properties of the tumor ECM. In this model LX2 and HepG2 cells embedded in a hydrogel matrix were seeded onto the inverted transmembrane insert. HUVEC cells were then seeded onto the opposite side of the membrane. Three formulations consisting of ECM-hydrogels embedded with cells were prepared and the bio-physical properties were determined by rheology. Cell viability was determined by a cell viability assay over 21 days. The effect of the chemotherapeutic drug doxorubicin was evaluated in both 2D co-culture and our 3D model for a period of 72h. Rheology results show that bio-physical properties of a fibrotic, cirrhotic and HCC liver can be successfully mimicked. Overall, results indicate that this 3D model is more representative of the&#160;in vivo&#160;situation compared to traditional 2D cultures.&#160;Our 3D tumor model showed a decreased response to chemotherapeutics, mimicking drug resistance typically seen in HCC patients.&#160;

This protocol presents a 3D biomimetic model with accompanying fibrotic stromal compartment. Prepared with physiologically relevant hydrogels in ratios mimicking the bio-physical properties of the stromal extracellular matrix, an active mediator of cellular interactions, tumor growth and metastasis.

神経癌の生物模倣モデルが、調整可能な生体特性を有する3D環境における腫瘍-ストロマ相互作用を研究する

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

操作された複合三次元組織<em&gt;インビトロ</em&gt; /<em&gt;インシリコ</em具体的な突然変異背景に薬物の有効性を予測するための&gt;肺腫瘍モデル

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

生物工学

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

ラットにおけるジメチルニトロソアミン誘発性肝線維症モデル

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

医学

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver transplantation, has several limitations. Promising solutions have emerged in the field of liver regenerative medicine, with liver organogenesis holding significant potential. Early liver organogenesis, occurring between E8.5 and 11.5, involves the formation of epithelial-mesenchymal interactions leading to morphogenesis, hepatic cord formation, and collective migration. However, there is a lack of methods for in vitro modeling of this process. In this study, a detailed series of methods is presented, enabling the modeling of various stages and aspects of liver organogenesis with human cell lines. In one method series, assembloid technology with hepatic (HEP) and mesenchymal (MES) spheroids are utilized, replicating early structures found in liver organogenesis, modeling early morphogenesis, and demonstrating interstitial cell migration as seen in vivo. These innovative assembloid systems help identify factors influencing assembloid formation and migration. HEP spheroid cultivation systems were also employed to model collective migration and branching morphogenesis. Mesenchymal-conditioned media (M-CM) plays a significant role in initiating dose-dependent branching migration. All presented methods were shown to be highly reproducible with a high success rate. By linking these events together, our work will enable recreating sequential, morphogenetic events to reverse engineer organogenesis in vitro and in vivo.

Organoids revolutionize personalized tissue modeling for organ development, drug discovery, and disease research. Organoid engineering advances into creating intricate synthetic tissues. The aim is to integrate morphogenesis, assembloid technology, and biomatrices to advance tissue engineering. This protocol aids in modeling liver organogenesis and establishing guidelines for synthetic tissue construction.

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

ダクト:3D肝臓解析のためのマイクロコンピュータ断層撮影に続く二重樹脂鋳造

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can progress to fibrosis and eventually to cirrhosis, a significant risk factor for hepatocellular carcinoma. The extracellular matrix (ECM) provides structural support and maintains liver homeostasis via matricellular signals. Liver fibrosis results from an imbalance in the dynamic ECM remodeling process and is characterized by excessive accumulation of structural elements and associated changes in glycosaminoglycans. The typical fibrosis pattern of NASH is called &#34;chicken wire,&#34; which usually consists of zone 3 perisinusoidal/pericellular fibrosis, based on features observed by Masson&#39;s trichrome stain and Picrosirius Red stains. However, these traditional thin two-dimensional (2D) tissue slide-based imaging techniques cannot demonstrate the detailed three-dimensional (3D) ECM structural changes, limiting the understanding of the dynamic ECM remodeling in liver fibrosis.
The current work optimized a fast and efficient protocol to image the native ECM structure in the liver via decellularization to address the above challenges. Mice were fed either with chow or fast-food diet for 14 weeks. Decellularization was performed after in situ portal vein perfusion, and the two-photon microscopy techniques were applied to image and analyze changes in the native ECM. The 3D images of the normal and NASH livers were reconstituted and analyzed. Performing in situ perfusion decellularization and analyzing the scaffold by two-photon microscopy provided a practical and reliable platform to visualize the dynamic ECM remodeling in the liver.

The present protocol optimizes the liver in situ perfusion/decellularization and two-photon microscopy methods to establish a reliable platform to visualize the dynamics of extracellular matrix (ECM) remodeling during non-alcoholic steatohepatitis (NASH).

非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスにおける肝臓細胞外マトリックスの3Dイメージング

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

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