Name: detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients
Uploaded: 2020-09-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
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著者らは、がんゲノミクス研究所と複雑疾患のバイオコンピューティングのメンバーに、鋭い観察的なインプットと、このプロジェクトのさまざまな段階での複数の議論への参加に感謝したいと考えています。資金援助には、イスラエル癌協会(M.F-M 2017-2019のICA助成金)とイスラエル革新機関のカミン助成金(M.F-M.)が含まれます。

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

チューブ内の患者の血液の収集、出荷および貯蔵は液体生検の重要な初期ステップである。不適切な取り扱いは、プラズマの品質を損なう可能性があり、したがって、液体生検47の結果を妨げる可能性がある。血液サンプルがEDTA血液管に採取された場合、血漿は、BPCのリシスおよび血漿48へのそのゲノムDNAの放出を避けるために、採血の2時間以内に分離さ?...

技術の進歩は、何百もの癌ゲノムとトランスクリプトム1のシーケンシングにつながっています。これは、異なる癌タイプ間の分子変化の風景を理解するのに貢献しています 2.これらの景観に関するさらなる研究は、癌または腫瘍の進行に関与する逐次体細胞変化および遺伝子遺伝子融合3 を特徴付け、アポトーシス経路4を連続的に破壊することによって助けた。したがって、体細胞変異および遺伝子融合は、特定の腫瘍タイプ5の個々の患者においてバイオマーカーとして機能し、既存の原発性腫瘍予後6を同定し、分子変化に基づいて二次腫瘍を分類し、薬物性腫瘍標的を同定することにより、腫瘍に関する情報を提供することができる。このような情報は、がん患者に対する個別の治療を選択し、陽性および陰性の治療応答を決定する際に容易にすることができる9.しかし、腫瘍組織のゲノムプロファイリングを同定するための腫瘍物質を得ることは、侵襲的な手順10である。さらに、腫瘍生検は異種腫瘍のごく一部のみを含む。したがって、腫瘍11全体の分子プロファイルを代表するものではなくてもよい。連続モニタリングおよび腫瘍ジェノタイピングは、腫瘍組織の繰り返し収集を必要とするが、これは、通常、腫瘍生検処置の侵襲性およびそのような手順12から生じる安全性の問題のために実現不可能である。
一方、液体生検技術は、過去10年間で精密腫瘍学で大きな注目を集めています13,14.これは主にこの技術の非侵襲性によるものであり、複数の時点で繰り返される可能性があるため、疾患コース15,16に対する使いやすく安全なモニタリング技術が可能となる。液体生検は、腫瘍細胞が急速に増殖し、同時に多くの細胞がアポトーシスと壊死を起こる現象に基づいています。これは、アポトーシス17の間に正確なサイズで切断されるDNA断片と共に、患者の血液中にアポトーシス細胞の破片の放出をもたらす。非癌性細胞のアポトーシスは、その細胞の破片の血液への放出にもつながり、しかし、これらの細胞におけるアポトーシス率は腫瘍細胞18より比較的低い。液体生検技術の合理的な方法は、血液中を連続的に循環するDNA、RNA、タンパク質、および腫瘍細胞14、19などの腫瘍関連分子を捕捉することである。次世代シーケンシング(NGS)、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(ddPCR)、リアルタイムPCR、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)など、これらの分子の分析に種々の技術20を用いることができる。液体バイオプシー技術により、腫瘍細胞の特徴であるバイオマーカーを同定することができます。これらのバイオマーカー分子は、腫瘍の特定の部分から放出されるだけでなく、腫瘍21のすべての部分から放出される。したがって、液体生検で同定されたマーカーは、異種腫瘍全体の分子プロファイリングを表し、体内の他の腫瘍に加えて、組織生検ベースの技術22よりも優れたものを有する。
cfDNAは、数分から1〜2時間23に及ぶ循環血液中の短い半減期時間を有する。しかし、cfDNAの短い半減期は、治療応答と動的腫瘍評価を評価することによってリアルタイム分析を容易にする。腫瘍由来cfDNAレベルは、いくつかの研究によって証明された腫瘍段階/サイズの予後を示し、cfDNAレベルと生存結果24との関係を示した。さらに、cfDNAが既存の腫瘍マーカー25よりも優れた予測能力を有することが研究で証明されている。cfDNAの予後は癌治療後にさらに顕著であり、cfDNAの治療後の高いレベルは生存率の低下と良好に相関し、治療に対する耐性を有する。一方、cfDNA療法の低レベルは、一般的に陽性治療応答に対応する。さらに、cfDNAは従来の検出方法よりも治療応答の早期検出を促進する。
cfDNAは、癌関連突然変異の早期発見の可能性を高める:早期疾患15の間に、症状26 の発症および癌診断前2年27年まで。cfDNAは複数の腫瘍領域または病巣から放出されるので、その分析は、それが28を表す腫瘍ゲノムの包括的なビューを提供する。したがって、cfDNAは、組織サンプル29で見逃された可能性のある体細胞突然変異を検出することを可能にする。腫瘍内不均一性およびクローン下突然変異は、数千の塩基に及ぶゲノム領域の深いシーケンシングによって検出することができるので、cfDNAの分析は、明確なゲノムシグネチャ13を有する特定の分子サブタイプを発見することを可能にする。組織サンプルを通じて同様のレベルの情報を得るためには、多くの固体生検が必要であったであろう。
さらに、手術後の結腸、卵巣、肺癌などの局在性疾患を有する患者におけるcfDNAレベルおよび/または化学療法は、癌再発および治療結果20に対する強力な予後マーカーであることが実証された。さらに、結腸、乳癌、肺癌の患者では、血液からのcfDNAの分析は腫瘍特異的な変化を正常に検出することができ、これは数ヶ月前に再発の正確な予測につながった13。さらに、抗EGFR療法30を受けたCRC患者におけるKRAS突然変異などの治療抵抗マーカー様々な治療法による治療後の乳癌患者におけるPIK3CA、MED1またはEGFRなどの遺伝子のVAF31; EGFR標的TKU32で治療された肺癌患者におけるEGFR T790M耐性変異とEGFR T790M耐性変異もcfDNA分析によって同定することができる。
要約すると、cfDNA分析は、腫瘍学13、33の分野における正確なバイオマーカーを同定するために使用することができる。このプロトコルでは、3人のグリオーマ患者と3人の健康なコントロールの血液サンプルを処理し、血漿からWbCsおよびcfDNAからゲノムDNAを得た。グリオーマ癌において、IDH、TERT、ATRX、EGFR、およびTP53の突然変異は、グリオーマ腫瘍の早期診断に役立つ診断および予後マーカーとして機能し、異なるタイプのグリオーマ腫瘍を分類し、個々の患者に対する正確な治療を導き、治療応答34、35を理解する。 これらの遺伝子の変異状態は、血液由来cfDNAを用いて同定することができる。本稿では、神経膠腫癌12の変異変化を研究するために用いられてきた血漿由来cfDNAの詳細なプロトコルを提示する。この記事で説明されているこのようなcfDNAベースの液体生検プロトコルは、他の多くのタイプの癌の突然変異変化を研究するために使用することができる。さらに、最近の研究では、cfDNAベースの液体生検が50種類の癌36を検出できることを示している。
血液サンプル採取、保存、および出荷は、これらのステップ中の制御されていない温度がWBCのリシスを引き起こし、WBCから血漿中にゲノムDNAが放出され、cfDNAサンプルの汚染を引き起こし、手順37の残りの部分に影響を与えるため、このプロトコルにおいて重要なステップである。制御されていない温度による浸透圧は、PCRステップ38のようなcfDNAの下流サンプル調製プロセスを損なう可能性がある。血清は血漿ではなく生殖細胞系cfDNAの割合が高いが、腫瘍関連cfDNA39には大きなバックグラウンドノイズを示す。従って、腫瘍関連cfDNAを単離するためには、血漿は、適当な試料39である。採血管を含む抗凝固剤に採取された血液は、血漿を分離し、cfDNA汚染を避けるために、直ちにまたは最大2時間以内に遠心分離する必要があります。このプロトコルでは、専用の市販のcfDNA保存血液採取管(材料表を参照)が使用されており、これは採血管を含む抗凝固剤の代替である。これらの専用の採血管はcfDNAおよびcfRNAを維持し、周囲温度で30日まで、そして37°Cで8日間まで、Wbcのリシスを防ぐ。 これは、血液サンプルの出荷中および血漿とWBCが分離されるまで適切な温度を維持することを容易にする40.
現在利用可能なcfDNA抽出方法論には、位相分離、シリコン膜ベースのスピンカラム、磁気ビーズベースの絶縁41の3種類があります。シリコン膜ベースのスピンカラム法は、他のcfDNA抽出方法42と比較して、高い完全性を有する高い量のcfDNAを生み出した。
DNAの定量的評価は液体生検における基本的な要件であり、その容易な実施および広い使用のための簡単で、現実的で、標準化された手順を開発する必要性がある。cfDNA定量に一般的に使用される3つの方法は、分光光度測定、蛍光測定法、およびqPCRです。この蛍光測定法は、精度、コスト、および伝導の容易さ43に関する他の方法よりも優れている。
cfDNAの完全性および純度はアガロース電気泳動か毛細管電気泳動によって推定することができる。アガロース電気泳動は、cfDNAの低濃度で感度を示すことも、cfDNAの正確なフラグメントサイズを示す高分解能も示していません。一方、毛細管電気泳動は、関連する課題を克服することでアガロース電気泳動よりも優位性があり、したがってcfDNAフラグメントサイズ分析のために研究者によって広く使用されています。このプロトコルでは、分離されたcfDNAのフラグメントサイズ分布を、自動キャピラリー電気泳動器を用いて推定した( 材料表を参照)。

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>G2939BA</td><td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td></tr><tr><td>Adjustable Clip for Priming Station</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5042-1398</td><td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5067-4626</td><td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td></tr><tr><td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td><td>Norgen Biotek Corp.</td><td>63950</td><td>Norgen&#039;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td></tr><tr><td>Chip Priming Station</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5065-4401</td><td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&amp;mdash; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td></tr><tr><td>Electrode Cleaner Kit</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5065-9951</td><td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td></tr><tr><td>Filters for Gel Matrix</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>185-5990</td><td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td></tr><tr><td>IKA Basic Chip Vortex</td><td>IKA-Werke GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>MS-3-S36</td><td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue kit</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells&lt;br/&gt; (e.g., bacteria), and many other sources.</td></tr><tr><td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td></tr><tr><td>QIAvac Connecting System</td><td>Qiagen</td><td>19419</td><td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Qubit assay tubes are 500 &amp;micro;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&amp;micro;L to 100 ng/&amp;micro;L.</td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>Qiagen</td><td>84010</td><td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crushed ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (96&amp;ndash;100%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating block or similar at 56 &amp;deg;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (100%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (adjustable)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

がん患者の腫瘍の変異を特定することは、疾患管理において非常に重要なステップです。これらの突然変異は、腫瘍診断のためのバイオマーカーとしてだけでなく、癌患者における治療選択および応答のために役立つ。腫瘍の突然変異を検出するための現在の金標準法は、腫瘍生検による腫瘍DNAの遺伝子検査を伴う。しかし、この侵襲的な方法は、腫瘍突然変異レパートリーのフォローアップ試験として繰り返し行うことは困難である。液体生検は、使いやすく非侵襲的な生検アプローチとして腫瘍突然変異を検出するための新しい新しい技術です。
がん細胞は急速に増殖します。並行して、多数の癌細胞がアポトーシスを受ける。これらの細胞の破片は、腫瘍DNA突然変異を運ぶ無細胞DNA(cfDNA)断片と呼ばれる細かく断片化されたDNA片と共に、患者の循環系に放出される。そこで、液体生検法を用いてcfDNAベースのバイオマーカーを同定するため、血液サンプルを癌患者から採取し、続いて血漿およびバフィーコートを分離する。次に、血漿はcfDNAの単離のために処理され、それぞれのバフィーコートは患者のゲノムDNAの単離のために処理される。その後、両方の核酸サンプルの量と品質がチェックされます。次世代シーケンシング(NGS)技術を用いて変異を解析する。
本稿では、血液採取、血漿、バフィーコート分離、cfDNAおよび生殖系列DNA抽出、cfDNAまたは生殖系列DNAの定量化、cfDNA断片濃縮分析を含む液体生検の詳細なプロトコルを紹介する。

プラズマ分離 cfDNAまたはcfRNA保存チューブで採取された8.5〜9 mLの血液は、体積の約〜4 mLの血漿を得る。EDTAチューブに採取された血液から分離された血漿の体積は、温度によって異なる場合があります。37°Cより高い温度で血液を含むEDTAチューブの暴露は、血漿体積収率44の低下をもたらす。
フルオロメーターアッセイ結果<br...

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Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

本論文では、非侵襲的な液体生検法の詳細なプロトコルを紹介し、血液採取、血漿およびバフィーコート分離、cfDNAおよび生殖系列DNA抽出、cfDNAまたは生殖系列DNAの定量、cfDNA断片濃縮分析を含む。

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.9K ビュー.  Bar-Ilan University. 本論文では、非侵襲的な液体生検法の詳細なプロトコルを紹介し、血液採取、血漿およびバフィーコート分離、cfDNAおよび生殖系列DNA抽出、cfDNAまたは生殖系列DNAの定量、cfDNA断片濃縮分析を含む。

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

がん研究

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマ コピー数検出

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

アンチ PD L1 抗体は生検で非小細胞肺癌患者からの細胞のサンプル集中 22 3 を使用して

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, and nucleic acids originating from normal tissues, but some of these substances also originate from the diseased area. The investigation and analysis of these substances in the body fluids play a pivotal role in the diagnosis of various diseases. Therefore, it is important to accurately separate the required substances, and several techniques are developed to be used for this purpose.
We have developed a lab-on-a-disc type of device and platform named CD-PRIME. This device is automated and has good results for sample contamination and sample stability. Moreover, it has advantages of a good acquisition yield, a short operation time, and high reproducibility. In addition, depending on the type of disc to be mounted, plasma containing cell-free DNA, circulating tumor cells, peripheral blood mononuclear cells, or buffy coats can be separated. Thus, the acquisition of a variety of materials present in the body fluids can be done for a variety of downstream applications, including the study of omics.

This paper describes the application of automated equipment to easily and efficiently separate and collect substances, such as cell-free DNA and circulating tumor cells, from whole blood.

臨床検体からのがん関連物質の自動分離・回収

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

Isolation of Circulating Cell-free DNA (cfDNA): A Silica-based Membrane Procedure to Extract cfDNA from Blood Plasma of Cancer Patients

Source: Palande, V. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61449" target="_blank">Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes a silica-based membrane procedure to isolate circulating cell-free DNA or cfDNA from human plasma sample. The cfDNA is a promising biomarker for cancer diagnosis and assessment.&#160;

循環無細胞DNA(cfDNA)の単離:癌患者の血漿からcfDNAを抽出するためのシリカベースの膜手順

Source: Palande, V. et al. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (2020)
This video describes a silica-based ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

神経系のがん

試験管研究

Automated Capillary Electrophoresis Based Fragment Size Distribution Analysis of cfDNA: A DNA Microchip-based Method to Study Size Distribution of DNA Fragments Isolated from Biofluids

Source: Palande, V. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61449" target="_blank">Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients.</a> J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we analyze the size distribution of cell-free DNA or cfDNA fragments using automated capillary electrophoresis. This technique helps gain insights into the profile of DNA fragments released by cancer cells during apoptosis.

自動キャピラリー電気泳動に基づくcfDNAのフラグメントサイズ分布解析:DNAマイクロチップを用いた生体液から単離されたDNAフラグメントのサイズ分布の研究法

Source: Palande, V. et al. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we analyze the size ...

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

要約

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