A.J.C、J.A.T、I.Lは、ホライゾン2020プロジェクトACEnano(グラントno.H2020-NMBP-2016-720952)。W.Zは、中国奨学金評議会(CSC、no. 201507060011からの博士号の資金調達を認めています。R.Rは、オランダ科学研究機構(NWO Vidi 723.0160330)のVidi補助金スキームの財政的支援を認めています。

人間のバイオ流体の使用は、ライデン大学とインスブルック医科大学からのIRBプロトコルガイドラインに従って承認されました.ヒトまたは動物の生物流体が調査される場合、研究機関からの倫理的承認が必要であり、本プロトコルに示された結果の場合に得られた。さらに、将来の作業9、29、30におけるデータの透明性と再利用性を確保するために、適切なレポートを実行する必要があります。
1. バックグラウンド電解質の調製(BGE)
注:すべての溶剤は、適切なヒュームフードで準備する必要があり、適切な個人用保護具は、すべてのステップ(ラボコート、手袋、ゴーグル)に使用する必要があります。各ステップでは、低結合プラスチックバイアルは、ガラス製品から浸出した塩でサンプルの検体損失と汚染を最小限に抑えるために必要とされます。
<ol><li>10%酢酸BGE(v/v)、pH 2.2を毎日メタボロミクス用に調製します。<ol>
<li>10 mLの体積フラスコに酢酸1 mLを加え、続いて脱イオン(DI)水をマークされたラインに添加し、完全に混合します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロテオミクス用の100 mM酢酸、pH 2.9を毎日準備します。<ol>
<li>10 mLの体積フラスコに酢酸57 μLを加え、続いてDI水を印のラインに加えて、完全に混合します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NM製剤
<ol><li>公表されたガイドライン31、32、33を使用して、NMを水に激しく分散させる。 注:このプロトコルの開発では、7つのNMが次のように使用されました:100および1,000 nmカルボキシレートポリスチレンは、それぞれタンパク質および代謝物コロナに使用されました。100 nm未修飾ポリスチレンNMs、ポリアクリレートまたはPVPポリマーのいずれかで未修飾またはコーティングされた13nmアナターゼTiO2 NMsおよび22nm未修飾SiO2 NMsをタンパク質および代謝物コロナの両方に使用した。この方法は、これらのNMを用いて開発および実証されたが、このアプローチは、NMの組成、サイズ、形状、および形態の広い配列に適用可能であろうことに留意すべきである。</li>
	<li>動的光散乱34、35、単粒子誘導結合プラズマ質量分析36、ナノ粒子追跡解析37、またはゼータサイザー34を用いたゼータ電位としての透過電子顕微鏡および表面電荷のいずれかを使用して、粒子サイズを特徴付け。</li>
</ol>3. 生体分子コロナ形成
<ol><li>2 mLのヒト血漿(または選択した生体液)を1 mLのアリコートに分割し、1つは代謝産物とタンパク質のコロナ用、もう1つは血漿メタボローム特性評価用に割り込みます。</li>
	<li>サーモミキサーで500rpmで軽く混合しながら、37°Cで1時間、ヒトプラズマ中の1mg/mLのNMをインキュベートします。インキュベーション遠心分離機に続いて、4°Cで15分間4,000 x g でサンプルをペレット化し、NMsをペレット化します。</li>
	<li>血漿上清を収集し、コロナの代謝物を分析します。タンパク質コロナ特性評価のためのNM-タンパク質コロナ複合体を保持します。</li>
</ol>4. タンパク質コロナ分離
<ol><li>NM-タンパク質複合体(ペレット)を1mLの10x PBSバッファーに再懸濁し、渦を2分間激しく再懸濁させて、アンバウンドタンパク質を除去します。PBS溶液を4000xgで4°Cで15分間遠心し、NMsをペレット化し、ペレットを邪魔することなく上清を慎重に除去する。</li>
	<li>ペレットを1mLの炭酸水素アンボネート緩衝液(ABC)(100mM、pH 8.0)と渦を2分間激しく再懸濁し、結合していないタンパク質および望ましくない塩を除去する。4°Cで15分間4,000 x g で遠心分離機をNMsをペレットにする。上清を削除し、廃棄します。この手順を繰り返します。</li>
	<li>10 mMジチオアシトールを含む20 μLのABCバッファー(100 mM pH 8)にNM-タンパク質ペレットを溶解することにより、タンパク質ジスルフィド結合を低減します。56°Cで30分間の還元液をインキュベートします。</li>
	<li>タンパク質を消化するには、0.1%界面活性剤を含むABCの20 μLに2μgのシーケンシンググレードトリプシンを加えます。37°Cで16時間消化液をインキュベートする。</li>
	<li>アルキル酸試料は、100mM ABCで55mMで20μLのヨウドアセトアミドを添加し、室温で20分間インキュベートする。</li>
	<li>20 μLの0.1 M HClを加えて界面活性剤を切断し、室温で10分間放置します。</li>
	<li>C18パック脱塩ピペットチップを用いてペプチドを濃縮・脱塩する。<ol>
<li>80 μL 0.1%のギ酸50%の酢酸50%の酸でチップを湿らせ、80 μL 0.1%のギ酸を5回洗浄し、サンプルを10回引き上げて溶出し、80 μL 0.1%のギ酸を5回洗い流してサンプルを2回溶出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルを凍結乾燥し、分析まで-20 °Cで保存します。</li>
</ol>5. 代謝物コロナ分離
<ol><li>ステップ3.3からNMプラズマインキュベーションから制御プラズマと上清を取り出し、サンプル調製中に氷の上に保管してください。</li>
	<li>それぞれ50μLを別々のバイアルに取り、DI水で10分の1を希釈します。希釈したサンプルを50μLずつ取り、ステップ5.3の新しいバイアルに移動します。</li>
	<li>200 μL クロロホルム、250 μL メタノール、350 μL DI 水を加え、2分間の渦混合物を2分間激しく加えます。4°Cで20,800 x g で10分間の遠心分離機。</li>
	<li>上清500μLを取り、4°Cで10,000 x g で2時間の3kDa遠心フィルターを通してフィルターを取ります。430 μLの超浸透液を取り、速度で乾かします。分析の前にサンプルを凍結できるようになりました。</li>
</ol>6. CESI-MSシステムの作成38
注意:毛細血管の取り付け前に、毛細血管の入口と出口の端がそのままであり、毛細血管に目に見える破損がないことを確認してください。
<ol><li>タンパク質コロナ分析のための中性コーティング毛細管の設置39.<ol>
<li>メーカーのガイドラインに従って、新しいニュートラルコーティングされたキャピラリー(30 μmの内部直径の90 cmの長さ)をCESI機器に取り込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロテオミクス解析のためのCESI毛細血管の調製<ol>
<li>100 psiで5分間HClの100 mMを使用して分離キャピラリーを前方方向に洗い流し、毛細管の出口で液滴形成を確認します。BGEで100 psiで10分間の分離キャピラリーをフラッシュし、100 psiでDI水を30分間洗浄します(これは新しい毛細血管にのみ必要です)。</li>
		<li>分離毛細血管と導電性キャピラリーの両方を90 psiでBGEで5分間洗い流し、両方の毛細血管の出口端に液滴が形成されるようにします。</li>
		<li>90 psiでDI水で分離キャピラリーを10分間洗い流し、0.1 M HClで10分間50 psi、続いてDI水で10分間90 psi、最後に90 psiで10分間BGEを洗い流します。先に説明したナノスプレーソースとアダプタを使用して、CESIをMSに結合します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>代謝物コロナ特性評価のための裸の融合シリカ毛細管の設置38.<ol>
<li>新しい裸のシリカキャピラリー(30 μmの内部直径の90 cmの長さ)を製造者のガイドラインに従ってCESIの器械に入れる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>メタボロミクス分析のためのCESI毛細血管の調製<ol>
<li>分離キャピラリーを50psiで100%MeOHで15分間使用して前方方向に洗い流し、毛細管の出口で液滴形成を確認します。分離毛細管と導電性キャピラリーの両方を90 psiで90 psiで5分間洗い流し、両方の毛細血管の出口で液滴が形成されるようにします。</li>
		<li>90 psiで10分間DI水で分離キャピラリーを洗い流し、0.1 M NaOHで10分間50 psi、続いてDI水で10分間90 psi、最後に90 psiで10分間BGEを行います。先に説明したように、ナノスプレーソースとアダプタを使用してESI-MSにCESIを結合します。38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. タンパク質コロナ分析用CE-MS
<ol><li>50 mM酢酸アンモニウム pH 4.0 のステップ 4.8 から 20 μL のサンプルを再中断します。</li>
	<li>5 psi 10 s の流体力学的注入をサンプルの実施します。30 kV分離電圧を使用して、1 psiで0-10分、1.5 psiで10〜35分、100 mMを使用して5 psiで35-45分、BGEとしてpH 2.9酢酸を使用して分離します。</li>
	<li>top-10 データ依存フラグメンテーション取得により、250 ~ 2000 m/z の質量スペクトルを収集します。</li>
	<li>サンプル間、0.1 M HClを用いて0.1 M HClを3分間100 psiで、BGEの10分100 psiで分離キャピラリーを分離し、導電性液体毛細管の場合は100 psiで3分間リンスします。</li>
</ol>8. 代謝物コロナ分析用 CESI-MS
注: すべてのサンプルは、陽イオン検出用に正のモードで 1 回、陰性モードで 1 回、陰性検出のために 2 回分析する必要があります。制御プラズマサンプルは、少なくとも5回分析する必要があります。
<ol><li>ステップ5.4から430μLのDI水と2分間の激しい渦中のNM露光および未露出したプラズマサンプルを再中断します。0.1 μmの膜フィルターを通してフィルター。</li>
	<li>95 μLの濾液を取り、200 μMでイオン(L-メチオニンスルホン)、陰イオン(2,2,4,4-D4-クエン酸)と渦に対して400 μMの内部標準を5 μL加え、渦を活発に加えます。CESI-MS分析前の4°Cで4,000 x g の遠心分離機を10分間行います。</li>
	<li>2 psiで30 s(カチオン)と40 s(陰イオン)のサンプル流体力学的に注入します。</li>
	<li>10% 酢酸で代謝産物を分離し、分離電圧は 30 kV で前方(カチオン)、逆(陰イオン)モードで分離します。逆分離モードは分離毛細管の0.5 psi前方圧力で補助される。</li>
	<li>質量分析計を設定して、質量範囲 65~1000 m/z で正(陽イオン)または負(陰イオン)モードでデータを収集します。サンプル間、0.1 M HCl、0.1 M NaOH、DI水、BGEを50 psiで2分間リンスします。</li>
</ol>

J.A.Tは、ACEnanoプロジェクト、J.A.Tの業界パートナーとして参加しているAB Sciex UK Ltdの従業員であり、他のすべての著者はこの作業に利益相反はありません。

これは、CESI-MSを使用して、同じサンプルからタンパク質および代謝産物を組み込んだ完全な生体分子コロナを特徴付けるために提案された最初の方法です。同じサンプルからタンパク質と代謝産物の両方を特徴付ける能力は、単一の実験的暴露から収集されたデータの量を大幅に増加させ、コロナ形成のプロセスとナノ医薬品としてのNMs毒性および有効性に対する新しい洞察を可能にします。さらに、CESI-MSは、必要なキャピラリーの変更だけで生体分子の両方のクラスを特徴付けるための理想的なプラットフォームです。今後、非水性CE用に開発された新しい方法により、CE-MS40 を用いて脂質工学を実行することが可能となり、単一のプラットフォームを用いてタンパク質、代謝物、脂質を分析できるようになりました。現在の従来のアプローチでは、タンパク質コロナ用と代謝物コロナ用の2つの専用LC-MSプラットフォームが必要です。したがって、このアプローチでは、単一の分析プラットフォームを使用して 2 倍のデータを収集できます。
このプロトコルはコロナの間接的な測定を提案しているので、このアプローチには特に代謝物コロナでいくつかの注意点があります。したがって、代謝産物レベルがNMsに対して高濃度で存在し、その後のマトリックス中の代謝産物濃度の低下が小さい場合に問題が生じることがある。しかし、タンパク質コロナとは異なり、各NMがユニークな表面化学を有するため、代謝物コロナを単離するための「1つのサイズがすべてに適合する」アプローチが開発される可能性は低い。今後は、代謝物コロナを分離するためのNM固有のアプローチが開発され、検証される可能性が高くなります。これは、その特定の NM にのみ適用されます。それにもかかわらず、CESI-MSは、それらがどのように分離されているかに関係なく、極性荷電代謝物の特性化に非常に適したプラットフォームです。また、NMsをペレット化するように設計された遠心分離工程中にペレットが形成されない場合、より高い遠心力が必要になる可能性があります。これは、密度の低い NM で発生する可能性が最も高いです。また、毛細孔の狭い穴のために、すべてのフィルタリングステップがプロトコル内に付着していることも重要であり、粒子状物質がサンプルから十分に除去されていない場合に容易にブロックされる可能性があります。
タンパク質コロナは、代謝物コロナとそれを組み合わせる能力は、バイオナノインターフェース6、14を研究する科学者のための新しい関心分野であるが、長年にわたって研究の強烈な領域であった。現在までに、これらの研究の大部分は、代謝物コロナ9,28の非極性、脂質分率に焦点を当ててきた。この電流法は、エネルギー代謝、解糖、およびDNA合成に関与する重要な代謝産物を含むコロナにおける極性および荷電代謝物の特性評価を可能にする。その結果、プロテオミクスワークフローと組み合わせると、生体分子コロナのより全体的な特徴付けが可能となる。これにより、バイオナノ相互作用の詳細な分析が可能になります。この方法は、タンパク質および膜受容体との代謝産物相互作用を介して、受容体媒介性エンドサイトーシスに対する強化された機械化的洞察を可能にする。さらに、タンパク質と小分子間のコロナ相互作用とコロナ内相互作用が探索される可能性がある。例えば、最近、コロナ中のタンパク質が代謝産物15の募集において重要な役割を果たしていることが示されている。図3と図4の代表的な結果は代謝産物の絶対定量化ですが、多変量データ分析を用いた非標的型アプローチは、露出したプラズマと比較してコントロール内のすべてのCE-MS機能を比較することで、代謝産物の結合も解明します。したがって、代謝産物およびタンパク質がNMコロナへのそれぞれの採用に影響を与える方法と、どのタンパク質を調査する重要な範囲があります。これらの追加研究は、ナノ医薬品の送達を最適化するためのコロナの設計や、生体分子コロナブロッキングやマスキングターゲティング機能による医薬品作用の抑制などの開発のさらなるハードルを明らかにするのに役立つ可能性があります。
約20 nL/minのナノスケールの流量と有機溶剤の使用の最小限の使用を有するCESI-MSは、それぞれ、メタボロミクスおよびプロテオミクス研究の主な課題である溶媒使用の点で、標準的なLC-MSおよびnanoLC-MSよりもグリーンおよび経済的な信任状の改善を提供する。CESI-MS は、LC-MS ベースの方法11,15と比較して、移行時間とピーク領域の両方に対して非常に再現性の高い結果を提供します。さらに、持ち越しは、CESI-MSでは、nanoLC-MSと比較して問題ではありません。したがって、サンプル分析の間の広範なシステムクリーンアップは必要とされず、サンプルスループット11が大幅に向上します。
要約すると、提案されたワークフローは、NMsの完全な生体分子コロナのタンパク質および代謝産物成分の両方を特徴付けるアプローチを最初に詳述するものである。これは、バイオナノ相互作用の新しい側面、代謝物コロナを解き放ち、同じサンプルから2倍のデータを収集することができ、バイオナノ界面での相互作用をより完全に理解することができます。

生体ナノ相互作用は、生体分子がNMに吸い込むナノ材料(NM)表面と生物学的マトリックスとの界面において、ナノセーフティとナノメディシン1を支える研究の激しい分野である。この吸着された生体分子の層は、生物学的同一性をNMsに与え、したがって細胞はそれらを「自己」として識別し、その後細胞の取り込み、分布および生物学的エンドポイント2、3、4に影響を与える。バイオナノ研究の大半は、コロナ内のタンパク質に焦点を当てており、タンパク質が異なる組成5のNMs間で定量的および定性的に変化することを実証している。この変動は、組成および塩分5を含む生物学的マトリックスの特性に加えて、サイズ、機能化、および材料などのNMの特性の両方に依存する。バイオナノインターフェースの関心の高まりの領域は、NMs6に吸い付ける代謝産物である。いくつかの研究は、タンパク質と同様に、NM特性がコロナ中の代謝産物の組成を決定する重要な要因であり、それらがNM曝露6、7、8の生物学的転帰に影響を与えることができることを実証している。
生体分子コロナの研究では、その特徴付けに4つの異なる相があり、コロナ形成、コロナ内の生体分子の単離、定性的または定量的質量分析および同定を介したそれらの検出9。現在までに、SDS-PAGEランニングバッファーでの沸騰、溶媒および塩抽出、またはNMsの表面上のタンパク質の直接消化を含むタンパク質コロナを単離する様々な技術が採用されています。コロナ中の代謝産物の観点から、分離は、溶液8、10、11として提案された溶媒またはNMsの溶解を用いた様々な方法でより複雑である。しかし、タンパク質コロナとは異なり、「1つのサイズがすべてに適合する」アプローチは、メタボロームが占める広い化学空間と可能なNMsの多様性のために、NMsからの代謝産物の単離に適用される可能性は低い。別のアプローチは、NMsへの代謝産物の吸着に起因する代謝産物濃度の差を有するNM曝露の前後の生物学的マトリックスを特徴付ける。
この代替アプローチは、すべてのバイオ流体とNMに適用され、2倍の分析が必要ですが、結果的に代謝物コロナのはるかに正確な尺度を提供し、NM表面からの低代謝物回収が特定の代謝産物の低結合と間違えられるリスクはありません。
生体分子コロナ解析の第2ステップは生体分子の検出です。伝統的にコロナのタンパク質のために、これはナノLC-MS、プロテオミクスの役馬のレビットでした。NMR13、1D、2DSDS-PAGEなどの他のアプローチも適用されています。代謝物コロナLC-MS7の観点から、GC-MS8および直接注入質量分析が利用された14.しかし、新しいアプローチは、最近、牽引力を得るために始まった、すなわち毛細血管電気泳動質量分析(CE-MS)11、15とNMsの様々な物理的および化学的特性を特徴付けるためのスタンドアロン技術としてNMラボに存在している。CE-MSは、nanoLC-MSおよびGC-MSに対する直交分離技術であり、極性および荷電代謝物17、18の検出を可能にすることができる。さらに、CE-MSは、タンパク質の分析およびリン酸化およびグリコシル化19、20、21、22などの翻訳後修飾に適している。最後のステップは、定量的/定性的または標的/対象化されていないアプローチが使用されている場合、これは、このプロトコルの残数の外にある場合に応じて、いくつかの方法で行うことができる。
CEI-MSは、CEとnanoESIインターフェースの組み合わせであり、シースレスインターフェースを利用したCE技術の最近の進歩です。これにより、超低流量CE(<20 nL/min)を希釈のない高分解能質量分析計に直接接続できるため、検出感度が23、24、25と大幅に向上する。CESI-MS は、高感度分析26を維持しながら、体積制限サンプル (< 10 μL) を分析できます。CESI-MSはまた、再現性27、28、スループットの点でプロテオミクスおよびメタボロミクスで使用される従来の低流量nanoLC-MSアプローチと良好に比較し、完全な生体分子コロナ特性評価のためのエキサイティングな見通しを作ります。
この研究は、完全な生体分子NMコロナのタンパク質および代謝産物の両方の側面からのデータを最大化するような方法で、単一のヒト血漿サンプルからNM生体分子コロナを単一の血漿サンプルから分離するために必要なサンプル調製物を説明する。我々は、ヒトの血漿の使用について報告するが、このプロトコルは、血清、完全な細胞培養培地、細胞リセート、脳脊髄液または尿などの他の生体流体に対して同様に適切であろう。これらの2つの成分(タンパク質および代謝産物)の分析は、カチオン性およびアニオン性代謝産物の両方に対して、タンパク質コロナおよび裸の融合シリカ毛細血管に対する中性コーティングされたCESI毛細血管を使用して記述される。

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Internal standard anion</td></tr><tr><td>Ammonium Acetate &gt;98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate &gt;99.5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Capillary cartridge coolant</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Vials</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxic, use in a fume hood</td></tr><tr><td>Glacial Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Internal standard cation</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Use in a fume hood</td></tr><tr><td>Microvials</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoVials</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Surface Cartridge 30 &amp;micro;M ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &amp;micro;m ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte buffered saline 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips, 100 &amp;micro;L bed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (surfactant)</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade modified Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide solution</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVP coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 uncoated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

周囲の生体マトリックスからナノ材料(NMs)の表面に生体分子を吸着してコロナを形成することは、過去10年間注目されてきました。バイオナノ界面への関心は、生体分子コロナが生物学的アイデンティティをNMに与え、身体がそれらを「自己」として識別するという事実から生じる。例えば、以前の研究では、コロナのタンパク質が細胞の取り込みに影響を与えるために膜受容体と相互作用することができることを実証し、コロナがNMsの細胞密売とその最終的な毒性を担っていることを確立しました。これまで、ほとんどの研究はタンパク質コロナに焦点を当て、完全な生体分子コロナの成分間のコロナまたは相乗効果に含まれる代謝産物の可能性のある影響を見落としてきました。このように、この研究は、ボトムアッププロテオミクスとメタボロミクスアプローチを並行して使用して、生体分子コロナのタンパク質成分と代謝産物成分の両方を特徴付ける方法論を実証する。これには、タンパク質回収を高めるために使用される界面活性剤を含むタンパク質コロナのオン粒子ダイジェストと、NM曝露前後の代謝物マトリックスを分析することによって代謝産物コロナの受動的特徴付けが含まれます。NMコロナ特性解析の新技術として、キャピラリー電気泳動(CESI-MS)を新たな技術として紹介します。ここで概説するプロトコルは、CESI-MSを使用して、NMsによって取得されたタンパク質と代謝物コロナの両方の信頼性の高い特性評価にどのように使用できるかを示しています。CESI-MSへの移行は、必要なサンプルの量を大幅に減少させます(従来の液体クロマトグラフィーと比較して – 質量分析(LC-MS)アプローチ) サンプルの少なくとも5 μLから複数の注入を可能にし、それは容量制限されたサンプルに最適です。また、CESI-MSの低流量(<20 nL/min)や有機溶剤の必要性を排除する水性電解質の使用により、LC-MSに対する環境負荷が低減されます。

記載された方法は、同じヒト血漿サンプルを用いてNM生体分子コロナ中のタンパク質および代謝産物の両方を特徴付ける最初の方法である。この方法は、>200タンパク質および>150代謝産物を検出することができ、完全な生体分子コロナの最も包括的な概要を決定することができ、NMsの細胞の取り付け、取り込みおよび影響の理解を強化することができます。
プロテオミクス(図1)とメタボロミクス(図2)の両方にCESI-MSを使用すると、分離と検出が各アプローチの両方の毛細血管に良好な分離ウィンドウを示しています。
この方法は、広範囲のNMs組成にわたってコロナ中のタンパク質を区別することができるため、幅広い物理的および化学的特性にわたるNMsへの方法の適用性を実証する(表1)。
代謝物コロナの一意の指紋は、この方法論のメタボロミック枝を使用して区別することもできる(図3)。このアプローチは、NM代謝物コロナを特徴付ける受動的なアプローチを利用しているが、異性体の微分吸着などの生体分子コロナにおける代謝産物の役割に関する興味深い洞察を明らかにすることができる(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> 図1:SiO2タンパク質コロナ分離の例示的な粒子消化に続くCESI-MSを用いた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> 図2:CE-MSにより血漿中の内因性化合物から得られたイオンエレクトロフェログラムの抽出例。 番号付き化合物は次のとおりです: 1. オルニチン;2. リジン;3. アルギニン;4. ヒスチジン;5. クレアチン;6. グリシン;7. アラニン;8. ヴァリン;9. イソロイシン;10. ロイシン;11. セリン;12. スレオンニン;13. アスパラギン;14. メチオニン;15. グルタミン;16. グルタミン酸;17. フェニル-D5-アラニン;18. フェニルアラニン;19. チロシン;20. プロリン;21. メチオニンスルホン (内部標準).オープンアクセスクリエイティブコモンズCC BYライセンスで公開され、Zhangら17から再現. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:6つのNMsアレイにわたるタンパク質コロナの分析。シリカ(SiO2)、チタニア(TiO 2)、PVPキャップチタニア(TiO2-PVP)、ディスペックスキャップチタニア(TiO2-Dispex)、ポリスチレンおよびカルボキシ化ポリスチレンNMsに対するタンパク質の豊富度を示す割合。異なるNMコロナにおけるタンパク質の相対的な存在量に観察された違いを考えると、この提案されたプロトコルは、異なるNMsのタンパク質コロナを区別するのに十分に敏感であることは明らかである。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> 図3:NMコロナにおけるカチオン代謝産物の標的分析。SiO2およびTiO2のNMsへのカチオンの吸着は、赤は代謝産物の初期濃度を指し、青は37°CでのNMsとの1時間のインキュベーション後の代謝産物の濃度を指す。溶液中の代謝産物濃度の低下は、NM表面への代謝産物吸着の結果である。ポリスチレンNMsに対して代謝物の有意な吸着は認められなかった。ボックスプロットは最小値と最大値、中央値および四分位間範囲を表す。オープンアクセスクリエイティブコモンズCC BYライセンス15の下で公開された代謝物コロナのCESI-MSターゲット分析から再現された図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> 図4:異性体吸着に焦点を当てたNMコロナ中のアニオン性代謝産物の標的分析。 チタニアのNMsの範囲への陰イオンの吸着は、例の糖リン酸塩のような様々な異性体の間に明確な違いを示す。赤色は代謝産物の初期濃度を指し、一方、青色は37°CでNMとの1時間のインキュベーション後の代謝産物の濃度を指す。溶液中の代謝産物濃度の低下は、NM表面への代謝産物吸着の結果である。SiO2 には代謝物の有意な吸着は認められず、ポリスチレンNMs.Boxプロットは最小値と最大値、中央値および四分位間範囲を表す。オープンアクセスクリエイティブコモンCC BYライセンス15の下で公開された代謝物コロナのCESI-MSターゲット分析から再現された図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>アナライト</td>
			<td>平均RSDピーク面積</td>
			<td>平均 RSD 移行時間</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928ペプチドの日中(n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 カチオンインデイ (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 カチオン間 (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:ペプチドおよびカチオン代謝産物に対するCESI-MS技術複製の再現性RSD:相対標準偏差、再現性の尺度として。CESI-MSのピーク領域と移行時間の再現性は非常に良好で、すべての検体は平均RSD<15%、移行時間は2.2%<。これらの結果は、この手法を用いて収集されたデータに起因する高い信頼度を示し、検出された変動が分析的変動ではなくサンプル組成(NMの濃縮)の真の違いによるものであることを確認した。表 2 は、前に11,15で示した結果から生成されます。

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Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

ここでは、毛細血管電気泳動-質量分析手法を用いて、ナノ材料が生体流体から得た完全な生体分子コロナ、タンパク質、代謝産物を特徴付けるプロトコルを紹介します。

ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.4K ビュー.  University of Birmingham. ここでは、毛細血管電気泳動-質量分析手法を用いて、ナノ材料が生体流体から得た完全な生体分子コロナ、タンパク質、代謝産物を特徴付けるプロトコルを紹介します。

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Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

生化学

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

毛細血管電気泳動質量分析によるメタボロミクス解析のための培養付着細胞からの水性代謝産物の抽出

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

がん研究

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

多角光散乱に結合したサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の特性化(SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

キャピラリー ゾーン電気泳動タンデム質量分析法による大規模なトップダウン プロテオミクス

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

化学

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

生物学

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T波イオンモビリティー質量分析：タンパク質複合体解析のための基本的な実験手順

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L</subキャプチャの複合質量分析法（CCMS）別> -ホモシステイン結合タンパク質

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

タンパク質相互作用を発見したHaloTag技術を用いたタンパク質機能の特性評価

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法

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