このプロトコルは、生物医学の用途で使用するための低沸点気化可能な液滴の多分散性を低減する容易な方法である。この技術は、事前に形成された気体マイクロバブルを凝縮し、制御可能でスケーラブルで比較的費用対効果の高い方法で、得られた液体液滴をサイズ別にフィルタリングします。この方法は、異なるフィルターを使用して異なるシェルおよびガス材料を持つ様々な脂質マイクロバブルに適用して、最終的な液滴サイズを制御することができます。
この手順を実証することは、Dr.Sirsiの研究室の学部研究者であるダラ・メリラットです。超音波装置の電源スイッチをオンにし、マイクロチップアタッチメントを使用して最大許容に振幅を設定し、超音波処理時間を10秒に設定します。温和化した脂質溶液を、表面のすぐ下にマイクロチップを付けたサウンドエンクロージャに入れます。
DFBタンク出口からエンクロージャに保持されている暖かい脂質溶液にガスを導くために、バイアルの首にチューブの適切な長さを取り付けます。液体の表面にわずかな波紋を引き起こし、ガスが脂質溶液の上を流れるのが見えるまで、タンクバルブをゆっくりと開きます。ガスの流れが高すぎると、マイクロバブル形成時に溶液が溢れます。
超音波処理器を起動し、マイクロバブルを生成するために連続して10秒間実行します。超音波処理が終わったら、すぐにDFBタンクバルブを閉じます。マイクロバブル溶液を素早くキャップし、バイアルを氷浴に沈め、サンプルを摂氏55度以下に冷却します。
200ナノメートルのセラミックフィルターを使用して、ユーザーズマニュアルに従って高圧押出機を組み立て、水密容器の中央に置き、サンプル出口管が側面に押し付けられたり、圧着したりしないようにします。メーカーから供給されたアダプターを使用して、押出機を窒素ガスタンクに結合します。出口管の端部をシンチレーションバイアルに入れて押出されたサンプルを集め、チューブをテープで容器に固定してバイアル内に留まる。
押出機内に圧力がないことを確認するために、リリースバルブを開閉します。チャンバーの蓋を取り外します。そして、押出機室にPBSの5ミリリットルを追加します。
蓋を取り替え、しっかりとクリックして元の場所に戻します。窒素ガスタンクを開き、圧力計が250 PSIを読み取るようにして、圧力制御弁が閉じた位置に位置していることを確認します。ガスタンクを閉じ、押出機室の入口バルブを開き、PBS溶液をシステムに押し込み、サンプル出口チューブをシンチレーションバイアルに出します。
ガスだけがチューブから出るとき、解放弁を開き、圧力がゼロPSIに落ちるようにしなさい。その後、シンチレーションバイアルを除去します。リリースバルブを開閉して押出機内に圧力がないことを確認し、出口管の端に新しいシンチレーションバイアルを配置します。
鋼容器に2-メチルブタンを充填し、ドライアイスを加え、温度をマイナス18度まで下げます。冷却された2-メチルブタンにマイクロバブル溶液を挿入し、サンプルを2分間水没させます。2分間にわたってシンチレーションバイアルを動かして、気泡を軽く混ぜます。
必要に応じてドライアイスを加え、マイナス15度からマイナス18度の温度を維持します。2分後、冷やした2-メチルブタンからマイクロバブルを取り出します。バイアルをそっと渦巻いてマイクロバブルを混ぜ、冷やした10ミリリットルのシリンジに泡を移します。
押出機室の蓋を取り外し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押してマイクロバブル溶液をチャンバーに加えます。押出機のキャップを交換し、しっかりとクリックします。押出機の圧力制御弁と解放弁が閉じた位置にあるか確認します。
圧力計が250 PSIを読み取るまで窒素ガスタンクを開きます。ガスタンクを閉じ、圧力制御バルブを開いた位置に回します。溶液が出口管でシンチレーションバイアルを満たし、ガスだけがチューブを出るとき、圧力解放弁をゆっくりと開き、圧力がゼロPSIに落ちるようにする。
押し出された液滴溶液の10ミリリットルを15ミリリットルの遠心分離管に移す。押し出されたサンプルを摂氏4度で10分間1,500倍Gで遠心する。溶液の上部に現れる上清と自然気化した液滴を捨てます。
DFPナノドロップレットを含むペレットを20%グリセロールと20%プロピレングリコールを用いたPBSの10ミリリットルで再懸濁する。押出しの有無にかかわらず凝縮された気泡溶液のサイズ分布は、凝縮されたサンプルが400ナノメートル付近を中心としたはるかに広い分布を有するのに対し、押し出されたサンプルは200ナノメートルを中心としたより狭い分布を有することを示している。過剰なリポソームを除去するために遠心分離によって洗浄された位相シフト液滴を分析するために使用される調整可能な抵抗パルスセンシング分析は、液滴サイズが200ナノメートル近くであることを示しています。
加熱するとナノドロップレット気化の顕微鏡データは、加熱前の視野で自然に気化した微小気泡が見え、加熱後に多くの気体マイクロバブルが観測されることを示しています。事前冷却せずに押出機に直接挿入されたナノ液滴の顕微鏡画像を、摂氏ゼロ度で、マイナス18°Cで凝縮して示しています。気化前後の凝縮されたオクタフルオロプロパン液滴の代表的な画像は、DFB液滴と同様に、加熱後のガスマイクロバブルの数も多いことを示しています。
この手順で覚えておくべきことは、液滴の収率が結露時の温度と圧力に大きく依存し、わずかな変動が結果に影響を与えるということです。気化可能な液滴を生成した後、それらは超音波だけでなく、他のin vivoおよびex vivoアプリケーションを使用して生体内イメージングおよび薬物送達を最適化するために使用することができる。この技術を開発した後、ナノドロップレットサイズとガスコア含有量が生体内気化閾値に及ぼす影響は、このプロトコルにわずかな変更を用いて検討されてきた。
