このプロトコルは、ヒト網膜組織内で直接代謝性網膜疾患の薬物治療法を発見および検証するための前臨床アプローチを提供します。この技術は、ヒト組織における代謝の複雑さと、細胞培養の多様性およびスループットを兼ね備えています。このアッセイを使用して、現在臨床安全性試験中の一般的で安全な脂質改変薬であるフェノフィブラートを使用して、網膜変性疾患であるMacTelの治療のための前臨床データを取得しました。
このアプローチは、栄養欠乏症、低酸素症、光毒性、その他の有毒脂質など、病気につながる一般的な網膜ストレッサーにいくつでも適用できます。培養24週目に、オルガノイドの外側に初歩的なセグメントが形成されているかどうかオルガノイドを確認します。26週目から28週目までに、外側のセグメントは厚い層を形成しているはずです。
厚い疑わしいセグメントが観察されたら、1ミリモルのデオキシSAストック溶液を0.51に希釈します。3ミリリットルの網膜分化培地中の1および2マイクロモル濃度プラス。解剖顕微鏡と滅菌プローブを使用して、ほぼ同じサイズと形状のオルガノイドの4つのグループを選択し、グループごとに最低5つのオルガノイドを選択し、グループを超低アタッチメント6ウェルプレートの個々のウェルに分割します。
すべてのオルガノイドを採取したら、各ウェルからできるだけ多くの培地を取り除き、各ウェルに1濃度のdeoxySA溶液を加えます。ビヒクルコントロールをオルガノイドの4番目のグループに追加します。2日間の培養後、培養上清を適切な新鮮なdeoxySAまたは対照希釈液と交換します。
4日間の培養後、クライオ切片を埋め込み、標準プロトコルに従ってオルガノイドを染色し、各培養液内の細胞死を評価できるようにします。染色後、5〜10倍の倍率を使用して、スライスされたオルガノイド切片の領域が無傷で整形成されており、オルガノイドの代表的な断面をサンプリングする平面内にある領域を見つけます。切片は、少なくとも数細胞の厚さの光受容体の明確な外顆粒層と、回復および染色を持たない核の別個の別個の別個の層を有するべきである。
画像をフレームに収め、倍率を20倍に増やします。次に、スライドを再度フレームに入れて、できるだけ多くの感光体層で画像を埋めます。Z 平面を設定し、Z 範囲の上限下限を設定して、スライスの深さ全体をイメージ化します。
次に、Zスタック取得で蛍光色素の3つのチャンネルすべてをイメージングし、ピクセルあたりの面積の比率を維持するファイル形式で画像を保存します。各サンプルの死細胞数を定量化するには、フィジーで画像スタックを開きます。バイオフォーマットのインポートオプションウィンドウで、[別々のウィンドウに分割]セクションの下にあるボックスがチェックされていないことを確認し、[画像]、[スタック]、および[Zプロジェクト]を選択して、定量化用の新しい画像を作成します。
回復と染色を示す画像チャンネルを選択し、ポリゴン選択ツールを使用して、画像内の光受容体の連続領域の輪郭を描きます。[計測値の解析と設定] をクリックし、[面積] ボックスを選択します。[分析と測定]をクリックして、光受容体の面積を測定し、死にかけている細胞をカウントします。
測定値がポップアップウィンドウに表示されます。選択した視細胞領域のアポトーシス陽性核をカウントするには、ポイントツールを右クリックしてマルチポイントツールを選択し、DAPI陽性核と重なるアポトーシス陽性染色を選択して回復および染色します。チャンネルを切り替えて、正のセルを検証します。
次に、アポトーシス陽性細胞の数を面積で除して、オルガノイドあたりの光受容体内の細胞死について正規化された値を取得します。標的細胞死を誘導するdeoxySA濃度を決定した後、滅菌プローブを使用して、ほぼ同じサイズと形状のオルガノイドの3つのグループを選択し、グループごとに最低5つのオルガノイドを選択します。そして、超低アタッチメント6ウェルプレートの個々のウェルにグループを追加します。
デオキシSAの標的細胞死濃度、目的の薬剤または対照培地を添加したデオキシSAの標的細胞死濃度を適切なウェルまたはオルガノイドに加える。2日後、各ウェルの上清を適切な濃度の新しい処理培地または対照培地と交換します。4日間の培養後、実証されたように培養物の細胞死を評価します。
この代表的な解析では、非黄斑毛細血管拡張症2型対照誘導多能性幹細胞株から作製した網膜オルガノイドを、4つの濃度のdeoxySAで処理した。デオキシSAに応答した細胞死は濃度依存性であり、わずか50ナノモルのデオキシSAで検出可能でした。試験した最高濃度は、網膜オルガノイドの完全性を維持しながら、堅牢な細胞死を誘導しました。
20マイクロモルのフェノフィブラートによる治療は、網膜オルガノイドの光受容体におけるデオキシSA誘発毒性を防ぎ、4日間の治療後に細胞死を約80%有意に減少させた。アッセイが網膜細胞で確実に行われていることを確認するために、整形式の健康なオルガノイドを選択することを忘れないでください。オルガノイドは、遺伝子発現を定量化するためにRNA収集用に処理することができ、ストレスシグナルの評価、毒性作用およびレスキューの検証を可能にします。
この技術を用いて、オルガノイド中の複数の異なる脂質の下流代謝をアッセイすることができ、ヒト網膜における脂質代謝の研究が開かれました。
