患者由来グリオーマ幹細胞を用いたGBMの潜在的併用療法を同定するための迅速スクリーニングワークフロー

グリオーマ幹細胞は、通常、化学療法および放射線療法に耐性である神経膠腫の細胞のサブ集団である。ここでは、グリオーマ細胞を分化するのではなく、グリオーマ幹細胞を標的とする併用療法を迅速に同定する方法について説明した。他の方法と比較すると、面倒で複雑な場合があります。

このプロトコルは、潜在的な有用な薬剤の組み合わせを識別するために、比較的簡単かつ迅速です。まず、グリオーマ幹細胞またはGSCを培養培地から採取し、室温で3分間Gの70倍に遠心します。上清を取り除いた後、摂氏37度で4分間アキュターゼで細胞を消化する。

200マイクロリットルのチップを用いて、細胞を繰り返しピペットして解約し、細胞ペレットを再懸濁させた。1ミリリットルの培養培地に200,000個の細胞の密度でGSCを加え、12個のウェル培養プレートの各ウェルに入れ、一晩インキュベートします。翌日、プレートの各ウェルに30マイクロリットルのルシファーゼ-eGFPウイルス上清を加える。

2時間Gの1000倍の細胞を摂氏25度で遠心分離し、一晩インキュベートする。翌日、GSCを採取し、遠心し、上澄み、新鮮な培地で再懸濁し、再めっきしてウェル内の培地を交換します。さらに48時間細胞を培養する。

蛍光顕微鏡でプレートを観察し、GFP陽性細胞の外観を確認します。フローセル選別機を使用して高蛍光を持つGSCを並べ替え、収集し、さらに培養します。コート、96ウェル光学底板、例えばマトリゲルなどの細胞外マトリックス混合物を、摂氏37度で1時間インキュベートする。

余分な混合物を取り除き、PBSでプレートを1回穏やかにすすいだし、100マイクロリットルの培養培地で1000細胞の密度でXG387-Luc細胞を種付けし、コーティングされたプレートの各ウェルに一晩培養します。翌日、顕微鏡で細胞を観察し、プレートへの付着を確認します。次に、200マイクロモルテモゾロミド溶液と2つのミクロモル溶液を培養培地で調製する。

併用薬物スクリーニングでは、ブランク培地を除去し、200マイクロモルテモゾロミドまたは2つのマイクロモル標的剤、または両方の組み合わせを含む培地を各ウェルに加えて、治療ごとに3つの技術的複製を行う。3日間、摂氏37度、炭酸ガス5%でプレートをインキュベートします。IVISスペクトルイメージングシステムを用いてプレート内の細胞生物発光の画像を撮ります。

内蔵のソフトウェアを使用して、対象領域の複数の円形領域を作成し、細胞生物発光を定量化します。テモゾロミドの抗グリア芽腫効果を増強できる候補を同定するために、20標的選択的小分子阻害剤を、薬物併用スクリーニングを通じて分析した。13の標的エージェントのセンシティブインデックス値はゼロを上回り、そのうち5人は0.1を超えていた。

上位2つの候補薬UMI-77およびA 83-01の感受性指数は0.25より高く、テモゾロミドと相乗する可能性を示唆した。テモゾロミドとUMI-77の併用処理を、6回の用量滴定マトリクスで抗増殖アッセイを用いて評価した。組み合わせインデックスの値が 1 未満でした。

また、高い単一薬剤値は、異なる濃度でのテモゾロミドとUMI-77の組み合わせの大部分でゼロよりも大きかった。XG387およびXG328 GSCの両方におけるテモゾロミドとUMI-77の全体的な相乗的相互作用を示唆する。このプロトコルは、単にプレートコーティングステップを除去することによって、接着癌細胞を用いて薬剤の組み合わせを見つける際にも適用することができる。