このプロトコルは、流体せん断ストレスの短いパルスに懸濁中の癌細胞を公開し、循環系にいる間に転移性癌細胞が血行力にさらされる方法の特定の側面を模倣する。これは、高レベル流体せん断応力の短いパルスを適用する比較的簡単な技術です。このプロトコルを試みるとき、制限されていない針に注意し、これは適用された力せん断応力を変更するので、それらを曲げないでください。
この手順はエアロゾルを生成する可能性があるため、適切な安全対策を講じてください。まず、成長培地を吸引し、5ミリリットルのカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSで10センチメートル皿を洗浄することによって、組織培養皿から70〜90%コンフルエントPC3細胞を放出する。その後、PBSを吸引し、0.25%トリプシンの1ミリリットルを加える。
トリプシン後、細胞の剥離を反転顕微鏡下で観察する。トリプシンを阻害するには、10%FBSを含むDMEM/F12培地を5ミリリットル添加する。次に、細胞懸濁液を円錐管に入れ、細胞濃度と総細胞数を決定する。
細胞懸濁液を3分間300xgで遠心分離し、次いで上清を吸引し、ペレットを無血清組織培養培地に再懸濁させる。7ミリリットルラインで14ミリリットルポリスチレンチューブの底部をカットし、混合細胞懸濁液をカットチューブに入れる。液体せん断応力暴露前に細胞の静的制御サンプルを別途収集し、アッセイを行います。
残りの細胞懸濁液サンプルを流体せん断応力にさらすために、細胞懸濁液を5ミリリットルのシリンジに引き込み、30ゲージの半インチ針を取り付けます。注射器ポンプに無制限の針でシリンジを置き、固定し、流体せん断応力の所望のレベルを達成するために流量を設定します。シリンジポンプを実行し、発泡を減らすために約45度の角度でカットチューブに剪断されたサンプルを収集します。
慎重に注射器ポンプから注射器を取り出し、それに触れないように注意して、針を取り除くためにペンチを使用しています。細胞懸濁液が流体せん断応力の所望のパルス数に曝されるまで、手順を繰り返します。細胞を流体せん断応力にさらす前に、静的サンプルで生存率アッセイを実行します。
酵素アッセイの場合、静的サンプルから100マイクロリットルのアリコートを複製して96ウェルプレートに移します。次に、流体せん断応力暴露後に100マイクロリットルのサンプルを採取し、96ウェルプレートに入れます。各サンプルウェルと100マイクロリットルの培地を含むウェルに、ミリリットルレサズリン溶液あたり0.15ミリグラムの20マイクロリットルを加えます。
37°Cの組織培養インキュベーターでウェルプレートを2時間インキュベートし、プレートリーダーを用いて蛍光と吸光度を測定し、各流体せん断応力暴露サンプルからの平均信号を平均から静電気制御試料に比較して生存細胞の割合を得る。同様に、静的サンプルからアリコートを収集し、テキスト原稿に記載されているようにフローサイトメトリーおよびクロノジェニックアッセイを行う。代表的な分析では、同種生検乳腺上皮癌細胞の生存率を、多くの流体せん断ストレスパルスに細胞を曝露した後のレサズリン変換を用いて評価した。
各細胞株は異なる抵抗プロファイルを示したが、流体せん断応力暴露の10パルス後の生存率に有意差はなかった。様々な組織起源からの追加の癌細胞株は、流体剪断応力からの機械的破壊に対する感受性のために10%未満の生存率を示したMIA PaCa-2細胞を除いて、流体剪断応力の10パルス後に20%以上の生存率を示した。流体を剪断応力を適用する前に静的サンプルを採取する場合は、細胞懸濁液が均一に混合されていることを確認してください。
慎重にペンチで針を取り外し、曲げたり、針に触れたりしないでください。細胞の生存率を測定することに加えて、遺伝子発現、細胞シグナル伝達、増殖、および移行の変化を評価することができます。これを流体せん断ストレスへの暴露のモデルとして使用して、がん細胞が流体せん断ストレスによる破壊に抵抗する方法と、流体せん断ストレスが癌細胞の生物学に及ぼす影響を評価する方法の両方を研究することができます。
この技術は、循環腫瘍細胞に対する流体せん断応力の影響を探るために、私たちの研究室や他の人によって使用されています。これらの研究は、流体せん断応力が癌細胞の機械的特性を急速に変化させ、これが流体せん断ストレスによる破壊に抵抗する癌細胞の能力に寄与することを示している。
