マクロピノサイトーシスは、癌代謝を含む様々な細胞プロセスにとって重要なエンドサイトーシス経路である。このプロトコルにより、インビトロで細胞におけるマクロピノサイトーシスの程度を定量することができます。この自動化は、再現性、生産性を最大化し、実験の変動を減らすことを目的としています。
さらに、蛍光顕微鏡により、サンプルを視覚的に検査して実験品質を決定し、追加のマクロピノソーム特性を評価することができます。私と一緒に手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるチェスカ・マリー・ガラパテです。カバースリップ形式の24ウェルプレートの場合、鉗子を使用してエタノールバスから単一のカバースリップを把持します。
カバースリップをプレートの内壁に叩きつけて余分なエタノールを除去し、カバースリップをウェルの底に平らに置きます。エタノールが蒸発した後、カバースリップをDPBSで2回洗浄し、次いで500マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加えることによってカバースリップの上に細胞を播種する。マクロピノソーム標識の前日に細胞コンフルエントが60〜80%に達するまで、5%二酸化炭素を含む37°Cの細胞インキュベーターに細胞を置く。
マクロピノソーム標識の前日に、ウェル内の培地を500マイクロリットルの予め加温した無血清培地と交換し、細胞をインキュベーター内に16〜24時間置いた。96ウェルマイクロプレートフォーマットの場合、細胞懸濁液を25ミリリットルの試薬リザーバに移すことから始めます。次いで、多チャンネルピペットを用いて、光学的に透明な環状オレフィンまたはガラス底を有する黒色96ウェル高含有スクリーニングマイクロプレートの各ウェルに細胞懸濁液100マイクロリットルをシードする。
マクロピノソーム標識の前日に細胞コンフルエントが60〜80%に達するまで細胞をインキュベートする。マクロピノソーム標識の前日に、真空ポンプに取り付けられた標準チップ用のマルチチャンネル吸引アダプターを使用して、各ウェルから培地を取り出し、廃棄する。あるいは、マルチチャンネルピペットを用いてもよい。
試薬リザーバおよびマルチチャネルピペットを使用して、予め加温した無血清培地100マイクロリットルを各ウェルに穏やかに加え、次いで細胞を細胞インキュベーター内に16〜24時間置く。カバースリップ形式の24ウェルプレートの場合、ウェル内の培地をフルオロフォア標識高分子量デキストランを含む200マイクロリットルの無血清培地と交換し、細胞を細胞インキュベーターに30分間置きます。インキュベーション後、培地を吸引し、予め冷却された洗浄ボトルを用いて氷冷PBSで細胞を穏やかに、しかし迅速に5回洗浄する。
洗濯中に手でプレートをしっかりと振って、カバースリップにくっついたデキストラン凝集体を脱落させてください。次に、3.7%ホルムアルデヒド350マイクロリットルを加えて20分間インキュベートして細胞を固定し、固定液を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄する。PBS中の350マイクロリットルのDAPIで核を染色する。
20分後、DAPI溶液を吸引し、PBSで細胞を3回洗浄する。シリコーンアイソレータを顕微鏡スライド上に並べて接着することで、イメージングの自動化に必要なカバースリップの均一な間隔と再現性のある局在化が得られます。次に、各カバースリップについて、アイソレータのオープンスペース内の顕微鏡スライド上に硬化蛍光マウント媒体の滴を加える。
鉗子を使ってカバースリップを拾い上げ、糸くずの出ないワイプでカバースリップの側面を軽く叩いて余分なPBSを取り除きます。次に、カバースリップを取り付けメディアの落下物の上に逆さまに置き、閉じた鉗子を使用してカバースリップを軽く叩いて、取り付けメディアから泡を取り除きます。スライドを暗い環境に保管し、マウントメディアを室温で乾燥させます(通常は16~24時間かかります)。
イメージングする前に、顕微鏡スライドからアイソレータを取り外します。スライドを室温まで平衡化した後、アンモニアフリーのガラスクリーナーで濡らした綿の先端のアプリケーターを使用してカバースリップを清掃します。その後、70%エタノールで濡らした清潔な綿の先端のアプリケーターを使用してカバースリップをきれいにし、乾かしたままにします。
96ウェルマイクロプレートフォーマットの場合、以前に実証したようにウェルを吸引した後、フルオロフォア標識高分子量デキストランを含む40マイクロリットルの無血清培地をウェルに加え、次いで細胞インキュベーター内で細胞を30分間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを逆さまに手動でフリックしてマイクロプレート内の培地を空の5リットルビーカーに廃棄し、次いで氷冷PBSで満たされた2リットルビーカーにプレートを垂直にゆっくりと浸して細胞とマイクロプレートを2回すすぎ、続いてプレートを5リットルビーカーに逆さまにフリックしてマイクロプレート中のPBSを捨てる。最後のPBSリンスの後、25ミリリットルの試薬リザーバおよびマルチチャネルピペットを使用して、PBS中の100マイクロリットルの3.7%ホルムアルデヒドを各ウェルに追加することによって細胞を固定する。
室温で20分間インキュベートした後、固定溶液を除去し、沈下およびフリック技術を用いてPBSで細胞を洗浄する。2回目のPBS洗浄後、1ウェルあたりPBS中の100マイクロリットルのDAPIで核を染色する。20分後、以前に実証したように、氷冷PBSで細胞を3回すすいでください。
マイクロプレートを裏返して糸くずの出ないワイプに叩きつけて、残留PBSを取り除きます。次いで、25ミリリットルの試薬リザーバおよびマルチチャネルピペットを用いて、100マイクロリットルの新鮮なPBSを各ウェルに加える。イメージングする前に、プレートを室温まで平衡化させ、細胞培養プレートを糸くずの出ないワイプで乾かして拭きます。
または、光から離れたプレートを摂氏4度で最大1週間保管してください。自動マクロピノソームイメージングでは、デキストラン蛍光色素分子とDAPIの波長チャネルに40倍の対空物レンズで画像を取得する自動化プロトコルを作成します。次に、最高レベルのマクロピノサイトーシスがあると予測されるサンプルを使用して露出設定を最適化し、信号の飽和と強度データの損失につながる可能性のある過剰暴露を回避します。
サンプルを簡単かつ一貫して見つけるフォーカス設定を使用して、高品質の画像を生成します。各ウェルまたはカバースリップ全体で複数の画像を取得して、サンプルの変動性を考慮し、サンプルの正確な表現を取得します。マクロピノサイト指数を決定するには、DAPIおよび対応するデキストラン画像の背景を、しばしば転がり球関数と呼ばれる適切な関数を適用して減算する。
DAPIおよびデキストラン信号に対する減算効果を最小限に抑えてバックグラウンドノイズが最小限に抑えられるように設定を調整します。次に、高いデキストラン信号を有するフィールドを用いて、しばしば閾値関数と呼ばれる強度信号設定を決定し、核を選択し、次いでマクロピノソームのみを選択するために必要な最小強度信号設定を決定する。デキストラン画像の場合、作成されたマクロピノソーム選択内の総蛍光を計算するか、選択を使用してデキストランの全面積陽性を決定します。
DAPI 画像の場合、選択を使用して画像内の核の数を決定し、存在する細胞の数を反映します。次いで、総デキストラン蛍光または面積をDAPIによって決定された細胞数で割ることによってマクロピノサイト指数を決定する。AsPC-1 PDAK細胞では、デキストランを添加する前にEGFを1ミリリットルあたり100ナノグラムで5分間添加すると、マクロピノサイトーシスが活性化されます。
さらに、マクロピノサイトーシスのオートクリンEGF活性化は、16〜24時間のグルタミン欠乏によって誘導され得る。MIA PaCa−2細胞は、75マイクロモルのEIPAによる30分間の処理または10マイクロモルのEHop−016による2時間の処理によって阻害される構成的マクロピノサイトーシスを示す。用量反応実験では、EHop−016およびEIPAのより高い薬物濃度でマクロピノサイト指数が徐々に低下し、それによって構成的Rac1依存性マクロピノサイトーシスの存在が確認された。
この手順を適応させて、アルブミンなどの他の蛍光タグ付き貨物のマクロピノサイトーシスを評価することができます。さらに、アルブミンのマクロピノサイトーシス取り込みが細胞生存率アッセイを行うことによって細胞適合性に寄与するかどうかを評価することが推奨される。この技術は、がんおよび間質細胞における大ピノサイト栄養素供給の同定の中心であり、自動化により、当社の状態検査能力が大幅に向上しました。
