このプロトコルは、モデル種シロイヌズナの機能的ゲノミクスにおける種子表面滅菌を改善する。この技術の主な利点は、1 日あたり数百サンプルの処理を可能にする、容易さと高スループットです。いくつかの簡単な変更を加えれば、この方法は他の多くのモデルや非モデルの植物種に適用できます。
初めてのユーザーのために、彼らは両方の種子生存に不可欠であるとして、媒体の温度と遠心速度に注意してください。まず、蒸留水に95%の工業用エタノールを加え、十分に混合して70%エタノールを調製します。次に、95ミリリットルの滅菌蒸留水に家庭用漂白剤5ミリリットルを加えて5%漂白液を調製する。
その後、漂白剤溶液に数滴の非イオン性洗剤を加え、十分に混ぜます。次に、ビタミンを含むMS培地粉末2.2グラムと800ミリリットルの蒸留水に10グラムのスクロースを加えて、半強度のムラシゲとスクーグ培地を調製します。水酸化カリウムのモル1個を用いて培地のpHを5.7に調整し、蒸留水を使用して体積を1リットルまで上げる。
アリコート500ミリリットルの培地を1リットルのボトルに入れ、4グラムの寒天を加えて固体培地を調製する。オートクレーブした後、水浴で50〜53度まで冷却します。その後、層流フードの下にペトリ料理にそれを注ぎます。
選択培地を調製するには、培地にカナマイシンを加え、先に示したようにペトリ皿に注ぎます。吸引器を設置するには、真空ポンプの入口を適当なサイズのポリエチレンチューブの一端に接続します。次に、チューブのもう一方の端をデカンテーションボトルの双方向蓋の出口に接続します。
チューブの接合部を密閉フィルムでしっかりと包み込み、気密性を確保します。次に、デカンテーションボトルのスクリューキャップの入口に2番目のポリエチレンチューブを接続します。次に、薄いポリエチレンチューブを取り付けた水槽弁の出口にチューブの反対側を接続します。
必要に応じて、シールフィルムで接合部を包み込んで、空気漏れを除去します。プログレッシブ番号を持つ48個の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブの2つのバッチにラベルを付けた後、96個の無菌マイクロ遠心チューブのそれぞれに100〜200のシロイヌナズナの種子を加え、チューブの円錐端の底から約1〜2ミリメートル上に追加します。次に、10ミリリットルの無菌血清ピペットを使用し、各チューブに70%エタノールの約1ミリリットルを加え、慎重に蓋を閉じます。
シェーカーで8ヘルツの振動周波数で3分間チューブを振ります。次に、シェーカーからアダプターを取り外し、パルス機能を使用して種子を回転させるベンチトップマイクロ遠心分離機のバスケットに移します。チューブをラックに移した後、ラミナーフローフードの下のすべてのチューブを開きます。
汚染を避けるためにチューブに取り付ける蓋の部分に触れないでください。次に、ラミナーフローフードの下に、無菌200マイクロリットルイエローチップを自家製アスピレーターの水槽用バルブ入口に装着し、ポンプをオンにします。液体を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルのすぐ上にチップを挿入します。
次に、10ミリリットルの滅菌血清学的ピペットを用いて、各チューブに5%漂白液の1ミリリットルをアリコートする。ふたを閉じてから、チューブをシェーカー アダプターに戻し、前に示したようにチューブを振ります。ベンチトップ遠心分離機のパルス機能を使用して種子を回転させた後、新しい無菌200マイクロリットルイエローチップを水槽バルブに取り付け、ポンプをオンにします。
漂白剤溶液を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルの上に先端を挿入します。次に、10ミリリットルの無菌血清ピペットを用いて、各チューブに1ミリリットルの滅菌水をアリコートする。水槽弁に新しい滅菌200マイクロリットル黄色の先端を取り付けた後、ポンプのスイッチを入れる。
水を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルのすぐ上にチップを挿入します。最後に、各チューブに殺菌水のアリコート500マイクロリットル、および層流フード内のすべての蓋を閉じる。種をまく準備ができました。
必要に応じて、チューブを室温で数時間または一晩で摂氏4度に保ちます。1ミリリットルのピペットを使用して、300〜400マイクロリットルの無菌水で種子をペトリ皿に移します。10本のチューブを移管した後、1.5~2ミリリットルの溶融半強度のムラシゲとスクーグ培地を各プレートに、抗生物質を入れずに注ぎます。
素早くプレートを旋回して種を分配し、反対側にプレートをテープで貼ります。プレートをプラスチックまたはアルミホイルで包み、暗闇の中で3日間冷蔵庫に入れて均一な発芽を得ます。2日目、3日目、4日目、7日目に行われた発芽分析では、70%エタノールによる10~40分の殺菌時間の間に有意な差は示さなかった。
しかし、殺菌時間が40分を超えると、発芽率は低下した。これに対応して、緑色のコチルドン出現率も低下した。研究に基づき、70%エタノールに対して3分間、5%漂白剤に対して3分間、種子を殺菌する最小時間として選択した。
もともと使用されていた種子が微生物で汚染されていることを実証するために、非無菌種子をプレートに直接播種した。無菌種子と比較して、非無菌種子は、7日間の発芽後にプレート全体に広がる2日後に真菌の出現を示した。異なる種子サンプルを処理するために単一の滅菌ピペットチップを使用して行われた交差汚染アッセイは、カナマイシンを用いたプレートに播種されたコロンビア-0遺伝子型種子では緑色のコチルドンが観察されなかったことを示した。
並行して、コロンビア-0種子ではカナマイシンなしでプレートに播種され、すべてのコチルドンは発芽後に緑色に見えた。これらの結果は、滅菌溶液を除去するために単一のピペット先端を使用したにもかかわらず、サンプル間の汚染の持ち越しを示さない。この手順は、遺伝子過剰発現、ゲノム編集、細胞内局在化、プロモーター活性、タンパク質とタンパク質-DNA相互作用などの他の多くの機能性ゲノミクス法の基礎となる。
