このプロトコルは、ユーザーが可溶性分子と結晶表面との間の相互作用を研究し、調べ、測定することを可能にするユニークな原因です。不凍タンパク質の氷への不可逆的な結合の強力な証拠、またはこの方法を使用して得られた。この技術の主な利点は、ミクロンサイズの氷と水和物結晶の成長を制御し、制御された方法でそれらの周りの溶液を交換できることです。
はじめに、あらかじめ用意した型をアルミホイルで覆われたガラスのペトリ皿に入れます。次に、硬化剤とエラストマーの1〜10個の混合物を秤量し、混合物が白くほぼ不透明になるまで約5分間連続的に混合することにより、30〜40ミリリットルのPDMS混合物を調製します。次に、PDMS混合物を型と一緒にペトリ皿に注ぎ、気泡がなくなるまでデシケーターで脱気します。
液体PDMSを使用して、ゴムのような粘稠度が得られるまで、オーブンまたは70°Cのホットプレートで金型を焼きます。次に、カビが壊れやすいので、メスではなくメスで前方に押すように注意しながら、メスで特徴の周りをなぞってデバイスを切り取ります。切り抜きPDMSデバイスを取り外した後、新しいペトリ皿に逆さまに置きます。
鈍い注射器、20ゲージの針を使用して、刻印されたパターンに基づいてデバイスに穴を開けます。次に、クリーニングしたPDMSとカバーガラスをプラズマクリーナーに挿入します。バルブを閉じ、電源、真空、ポンプをオンにします。
プラズマクリーナーを約1分間稼働させます。RFを高に設定し、細かいバルブを使用してプラズマクリーナーに空気が入るようにします。表示ウィンドウの色が紫からピンクに変わったら、プラズマクリーナーを50秒間作動させてRFをオフにします。
ポンプを1分間オンのままにし、オフにした後、メインバルブを徐々に開いて、プラズマクリーナーに空気を入れます。次に、PDMS表面をクリーニングしたカバーガラスに押し付け、カバーガラスを少し引き上げたときに剥離がないことを確認して、それらが接着されていることを確認します。ペンチで90度の鈍い針の針を固定した後、針の一方の端をタイゴンチューブに挿入し、もう一方の端をデバイスの打ち抜かれた穴の1つに挿入し、他の穴についてもこのプロセスを繰り返します。
銅製のコールドステージの表面に少量の浸漬オイルを塗布し、糸くずの出ないワイプを使用して広げて、オイルの薄い層を作成します。次に、作成した油層の上にきれいなサファイアディスクを置きます。次に、液滴をサファイアディスクの中央に塗布し、デバイスの機能がコールドステージの表示穴に揃うようにPDMSデバイスを液滴に配置します。
デバイスを所定の位置に保持した後、粘着テープを収納するアルミニウムボックスの外壁にチューブを固定します。ガラス注射器を使用して、4〜5マイクロリットルの不凍タンパク質溶液を入口チャネルに注入し、コールドステージの蓋を閉じます。温度制御プログラムを開始し、温度を摂氏マイナス25度に設定します。
その後、5秒あたり摂氏約1度でゆっくりと温度を上げます。サンプルの融点に近づけますが、不凍液タンパク質溶液に使用されるバッファーに応じて、摂氏マイナス1度からマイナス0.2度の範囲です。単結晶をよりよく観察するには、10倍または20倍の対物レンズに切り替えます。
そして、目的の場所で単結晶を得た後、結晶の端がチャネル壁に出会うまで温度をわずかに下げて結晶を成長させます。50倍対物レンズに切り替えた後、不凍タンパク質溶液をチャネルに注入し、蛍光強度の増加を観察し、タンパク質溶液がチャネルに正常に注入されたことを示します。溶液交換プロセスを記録するには、NIS-Elementsイメージングプログラムを使用して、加えられた圧力が高すぎないようにし、マイクロ流体デバイスの2番目の入口に緩衝溶液をゆっくりと注入します。
シリンジに加えられる圧力に依存する速度で蛍光シグナルの減少を観察します。THF水和物を得るには、モル比1〜15のTHF水溶液を調製した後、その溶液をマイクロ流体デバイスに注入する。THF水溶液が凍結した後、水和物を除いてすべての氷が溶けるまでゆっくりと温度を上げ、温度を摂氏1度で3分間保持します。
温度をマイナス2°Cに設定し、阻害剤がない状態でマイクロ流体チャネルに現れる水和物の量を観察します。次に、温度を調整しながらガラスシリンジを使用して不凍タンパク質または阻害剤をマイクロ流体チャネルに注入し、得られた結晶が溶融または成長しないようにし、阻害剤分子が結晶表面に吸着するまで数分待ちます。インヒビターフリー溶液をチャネルに注入することにより、溶液交換を行う。
溶液交換の前後に結晶の画像を撮影し、イメージングプログラムを使用して結晶上および溶液中の蛍光強度を分析します。氷晶の周りの溶液交換が成功し、溶液交換が比較的高速であることを示しています。ただし、交換が遅くなる可能性があります。
氷に吸着した不凍液糖タンパク質分子からの蛍光強度は、交換が完了した後にはっきりと観察されました。不凍タンパク質濃度の定量分析をモニターし、溶液中および氷上での蛍光強度を決定し、溶液交換中に溶液中の蛍光シグナルが100倍に減少し、氷表面上の計算されたシグナルが一定であることを示しています。THF水和物を用いたマイクロ流体実験は、水和物結晶が阻害剤分子を吸着させた後に、阻害剤を含まない溶液をチャネルに注入するところで行われた。
THF水和物は、フルオレセインイソチオシアネートで標識された不凍糖タンパク質と蛍光色素であるサフラニンOを含む2種類の阻害剤との溶液交換後に観察されました。この手順の重要なステップは、マイクロ流体チャネル内の単結晶の形成と単離、およびその周囲の溶液の交換です。この方法は、インヒビターがこれらの結晶と相互作用するメカニズムを理解するために、温度感受性の高い他の結晶材料とともに使用できます。
結晶の周りの溶液を交換する能力は、研究者が不凍タンパク質の結合メカニズムに関する重要な洞察を特定し、氷の成長に対する同位体効果の新しい現象を発見するための道を開きました。
