この方法により、初代ヒト造血幹および前駆細胞における再発性白血病原性機能獲得変異の正確なモデリングが可能になり、それによって白血病形質転換における役割を調べることができます。この技術の主な利点は、CRISPR-Cas9ベースの突然変異工学が蛍光レポーターの導入と組み合わされることです。これにより、純粋なヘテロ接合型変異細胞集団の同定、濃縮、追跡が独自に可能になります。
手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドク研究員であるTommaso Sconocchiaです。まず、オンラインのベンチリングデザインツールを使用して、プラス作成オプションを選択し、シングルガイドRNAを設計します。次に、をクリックします DNA配列「続いてDNA配列をインポートします」そしてデータベースからインポートする"オプション。
次に、目的の遺伝子を入力し、選択します 人間「種として。クリックしてください検索」オプションを選択し、正しいトランスクリプトインポートを選択します。二本鎖切断を導入する対象領域を選択します。
次に、画面の右側にあるCRISPR」オプションを選択し、続いてガイドを設計および分析します。次に、ガイド長を20塩基対に保ちながら、SP-Cas9で編集するためのPAMシーケンスを1つのガイドを選択します。高いオンターゲットスコアと高いオフターゲットスコアを持つガイドを選び、単一ガイドRNAを化学修飾合成シングルガイドRNAとして市販ベンダーから注文します。
HDRテンプレートを設計するには、ゲノム配列とコード配列を分子クローニング用のソフトウェアにインポートします。ゲノム配列ファイルから、理想的には二本鎖切断の5つの素端にある400塩基対を選択して左相同性アームを設計し、この配列を新しいファイルに貼り付けます。ゲノム配列ファイルから、標的イントロンの最後の150塩基対を選択し、それを左相同性アームの後に貼り付けることにより、スプライスアクセプター配列を設計する。
コード配列ファイルから、目的のcDNAを選択します。コドンはcDNAを最適化し、スプライスアクセプター配列の後に挿入します。目的のcDNAの後に、蛍光タンパク質のプロモーター配列に続いて3つの主要なポリアデニル化シグナルを挿入する。
次いで、蛍光タンパク質と第2の、しかし異なるポリアデニル化シグナルのための配列を挿入する。ゲノム配列ファイルから、理想的には二本鎖切断の3つの素端に400塩基対を選択して右相同性アームを設計し、2番目のポリアデニル化の後に配列を挿入します。次に、テンプレート全体のコピーを作成し、目的の変異の配列が含まれるように目的のcDNAを変更します。
蛍光タンパク質を別の蛍光タンパク質と交換する。HDR テンプレートを構築し、AAV 発現ベクターに複製します。組換えAAV6調製のために、10%FBS、1%ペニシリンストレプトマイシン、および25ミリモルHEPESを添加した20ミリリットルのDMEMに1100万HECK293Tを含む10個の150ミリメートル皿を準備します。
次に、皿を摂氏37度、5%二酸化炭素のインキュベーターに24時間置きます。古い培地を慎重に廃棄した後、10%FBS、25ミリモルHEPES、および1ミリモルの酪酸ナトリウムを添加した20ミリリットルの抗生物質を含まないDMEMと交換します。次に、チューブ1と2というラベルの付いた15ミリリットルチューブを2本用意します。
チューブ1に、5ミリリットルの還元血清培地、60マイクログラムの組換えAAV6変異HDRプラスミド、および220マイクログラムのPDGM6ヘルパープラスミドを加えます。チューブ2に、5ミリリットルの還元血清培地と1ミリリットルあたり1ミリグラムのポリエチレンアミン溶液1120マイクロリットルを加えます。チューブ2の内容物をチューブ1に加えた後、30秒間ボルテックスし、次いで室温で15分間インキュベートする。
各皿に1.1ミリリットルの溶液を慎重に滴下し、穏やかに旋回させて分配します。皿を摂氏37度、5%二酸化炭素のインキュベーターに48時間置きます。次に、250マイクロリットルの0.5モルEDTAを各皿に加え、10分間インキュベーターに入れます。
細胞を皿から洗い流して収穫し、500ミリリットルの遠沈管に移します。2000gで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を廃棄する。ボルテックスによってペレットを緩め、AAV精製キットを使用してウイルスを抽出します。
精製されたウイルスを分注した後、摂氏マイナス80度で保管してください。CD34陽性の造血幹および前駆細胞を解凍した後、1%ペニシリンストレプトマイシンを添加した10ミリリットルの予熱RPMIに細胞を移します。室温で350 Gで10分間遠心分離します。
造血幹および前駆細胞保持培地に細胞を1ミリリットルあたり250, 000細胞の濃度に懸濁し、摂氏37度および5%二酸化炭素で72時間インキュベートします。次に、細胞を15ミリリットルのチューブで収穫します。トリパンブルー排除による細胞生存率をカウントして確認する。
リボククレオタンパク質複合体を調製するには、15ミリグラムのCas9と8マイクログラムのシングルガイドRNAを1.5ミリリットルのチューブに加え、25°Cで10分間加熱ブロックでインキュベートします。リボ核タンパク質複合体がインキュベートしている間に、細胞を350 Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞を100マイクロリットルの核効果溶液に懸濁した後、細胞をリボ核タンパク質複合体と混合し、それらをキュベットに移す。
キュベットを軽くたたいて残留気泡を除去した後、キュベットをトランスフェクションシステムのホルダーに挿入し、細胞をエレクトロポレーションします。エレクトロポレーションの直後に、ペニシリンストレプトマイシンを含まない400マイクロリットルの予温された造血幹および前駆細胞保持培地を加え、ペニシリンストレプトマイシンを含まない予め温めた造血幹および前駆細胞保持培地を含む培養プレートに微細トランスファーピペットで細胞を移します。次にプレートをインキュベーターに移します。
凍結した組換えAAVを含むバイアルを氷上で解凍し、各組換えAAV6の最適量を細胞懸濁液にピペッティングして細胞を形質導入します。細胞懸濁液をピペットで穏やかに混合した後、形質導入した細胞を摂氏37度および5%二酸化炭素で6〜8時間インキュベートします。6〜8時間後、細胞をチューブに集め、室温で350 Gで5分間遠心分離します。
上清を廃棄し、ペニシリンストレプトマイシンを添加した新鮮な予温造血幹および前駆細胞保持培地と交換し、細胞を細胞培養プレートに移します。摂氏37度と5%二酸化炭素で48時間細胞をインキュベートします。ヘテロ接合機能獲得変異を有する改変細胞をフローソーティングするには、15ミリリットルのチューブで細胞を回収し、前述のように室温で350 Gで5分間遠心分離します。
上清を除去し、細胞を0.1%PSAを含む1ミリリットルのDPBSに懸濁し、室温で350 Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、前述のように、細胞数に応じて0.1%BSAを加えた適切な量のDPBSで細胞を懸濁します。キャップ付きの滅菌ファックスチューブに細胞を移し、生細胞/死細胞を排除するために7つのAADまたは他の生存色素を細胞懸濁液に加えます。
蛍光レポータータンパク質に対して二重陽性である生細胞を、200マイクロリットルの造血幹と前駆細胞保持培地を含む収集チューブに分類します。以前に実証したように、選別された細胞を室温で350 Gで5分間遠心分離した後、培養液でさらに増殖させるためにミリリットルあたり250, 000細胞の濃度にするか、機能アッセイのために細胞を直接使用します。リボ核タンパク質複合体によるトランスベクションおよび組換えAAV6ウイルスによる形質導入の2日後に、細胞をフローサイトメトリーで分析した。
野生型コンストラクトのみが組み込まれたGFPのみ陽性細胞、変異コンストラクトのみが組み込まれたBFPのみ陽性細胞、野生型配列と変異配列の両方が組み込まれたGFPおよびBFPダブルポジティブ細胞を含む、HDRベースのゲノム編集を行わず、GFPおよびBFPのダブルポジティブ細胞を含む4つの主要な集団が検出されました。ヘテロ接合型カルレティキュリン変異のノックインの成功を検証するために、AAVのみでインキュベートされた細胞、およびノックインされたカルレティキュリン野生型およびカルレティキュリン欠失配列でリボ核タンパク質とAAVでインキュベートされた細胞から抽出されたゲノムDNAに対してPCRを実行しました。細胞は、DNA抽出前の両方の蛍光レポーターの同時発現に基づいて選別した。
ゲル電気泳動後、個々のバンドをゲルから切除し、その後のサンガーシーケンシングのためにDNAを抽出しました。シーケンシングの結果、ヘテロ接合型のカルレティキュリン変異造血幹および前駆細胞における野生型および変異配列のシームレスな統合が成功したことが確認されました。この手順を試みる際に覚えておくべき最も重要なことは、全体的なHDR効率、したがってヘテロ接合型突然変異のノックインの成功頻度を決定するため、最も高性能なシングルガイドRNAを慎重に選択することです。
この手順に続いて、遺伝子操作された細胞は、コロニー形成ユニットアッセイ、分化アッセイ、および免疫不全マウスへの移植などの機能的なinvitroおよびin-vivo実験に使用できます。
