眼の後部として腫瘍を確立することは困難です。この方法は、マウスにおける再現性のある脈絡膜黒色腫腫瘍の誘導、および評価のための腫瘍増殖のライブイメージングを可能にする。このプロトコルは、OCTライブイメージングを利用して、腫瘍細胞接種時にすでに腫瘍の位置を評価し、生きた動物の腫瘍増殖を追跡します。
ブドウ膜黒色腫は、転移率が50%に近い壊滅的な病気です。実験モデルの開発は、新しい治療の可能性を目指した研究を進めるための鍵です。この方法の利点は、注射の成功を即座に評価することで、均質な腫瘍を有する研究グループに到達し、ライブイメージングによってそれらを継続的に追跡することができることである。
腫瘍の進行を調べる。小さなマウスの目に注射するには練習が必要です。注入された細胞を視覚化する機能により、成功をすぐに評価し、必要に応じてより多くのマウスで繰り返すことができます。
手順を実演するのは、カプランメディカルセンターの眼科研究所のディミトリゲイバー博士です。まず、麻酔をかけたマウスの両眼に0.4%局所眼科麻酔薬オキシブプロカインを塗布します。次に、瞳孔を拡張するために0.5%トロピカミドを両眼に局所塗布し、続いて目の乾燥を防ぐために潤滑剤として1.4%ヒドロキシエチルセルロースを塗布します。
マウスの片方の目を手術用顕微鏡で観察します。滅菌眼内鉗子でまぶたを開いたままにします。次に、上側頭辺縁結膜を保持し、鼻下の位置に向かって引っ張ります。
手順全体を通して辺縁結膜を保持することにより、この位置を確保します。30ゲージの針先を使用して、辺縁の後方約1〜2ミリメートルの背側頭領域に小さな結膜腹膜を作成します。腹膜の開口部から余分な腱嚢を取り除きます。
針先を挿入して強膜を貫通し、脈絡膜の茶色が強膜の露出した白質を通して現れるまで脈絡膜下腔にトラックを作成します。細胞を滅菌済みの10マイクロリットルのガラス製ハミルトンシリンジに、32度の角度でねじった32ゲージの鈍い針を取り付けます。装填した注射器の針を作成した管に約2ミリメートル挿入し、2マイクロリットルの細胞懸濁液を注入する。
注射後、すべての液体がなくなるまで2〜3秒間針を所定の位置に保持します。管からの漏れを防ぐために、針をそっと引き出して針を取り外します。メラノーマ細胞接種の直後に、注射した動物の眼をOCTスキャンにより観察する。
スキャンに基づいて、網膜剥離またはRDパターンを、局所RD、硝子体への漏出、または拡張RDの3つのカテゴリに従って分類します。OCTセグメンテーション解析ソフトウェアを開き、RDの高さに基づいて腫瘍のサイズを予測します。OCT スキャンでローカル RD の高さを測定し、3 つのグループに分類します。術後の段階では、オフロキサシンの0.3%を局所的に塗布する。
脈絡膜下細胞注入後の腫瘍増殖のOCTベースの予測をこの図に示します。マウスは、RD、焦点、硝子体への漏出、および拡張RDの3つのパターンを示しました。注射直後のRDのパターンと注射後5日目の腫瘍の局在との間には関連があった。限局性RDは、脈絡膜に限定された腫瘍細胞増殖と関連していた。
しかし、Focal RDを示す動物における注射後の硝子体の細胞の観察は、硝子体腔および脈絡膜における腫瘍増殖を示した。注射後に拡張RDが観察された場合、腫瘍は脈絡膜と硝子体全体に分散していました。このモデルで誘導される腫瘍サイズの範囲は、小、中、大に分けることができます。
ここに示されているのは、注射後のRD高さのOCT測定の代表的な画像、対応する眼底画像、注射後5日目の腫瘍の高さと幅の水平OCTスキャン、および対応する眼底画像、および同等の腫瘍測定値を示す対応するH&E染色眼切片です。細胞注入直後に小、中、または大のRDを示したマウスの腫瘍体積測定値をここに提示します。注射力を調整すると、腫瘍のサイズと位置に影響を与える可能性があります。
これを校正し、注射後のOCTによる網膜剥離の誘導パターンを評価することが重要です。脈絡膜腫瘍のライブイメージングは、腫瘍の進行に対するさまざまな要因または潜在的な治療法の効果を調べることを可能にする重要な実験ツールです。
