このプロトコルは、光透過電子顕微鏡および共焦点顕微鏡を使用してRP病理のマウスサイズを処理および評価する方法を説明する最初のプロトコルです。このプロトコルの主な利点は、統計的比較のためにこれら3つの画像技術を使用して、RP病理の定量的評価を含めることです。このプロトコルに記載されている技術は、RPEの健康に重要な分子経路に関する知識を広げるのにも役立つ可能性があります。
以前にマウスのサイズを解剖したことがない人は、このプロトコルに苦労する可能性があります。これらの個人は、このプロトコルで説明されている技術を習得するために、いくつかのマウスで練習することをお勧めします。まず、ドラフト内の心臓灌流用の吸収性アンダーパッドに重力供給灌流システムを準備します。
40ミリリットルの新たに調製した固定液緩衝液を灌流システムのシリンジバレルに注ぎます。バルブをチューブラインと平行に回して、バッファーがチューブラインを流れるようにします。すべての気泡がラインから除去されるまで、ラインをフラッシュします。
次に、バルブをチューブラインに対して垂直に回して、バッファーがチューブラインに流れ込まないようにします。心臓灌流を行うには、安楽死させたマウスを灌流システムの近くの浅いトレイに移します。腹部を上に向けて。
腹部に70%エタノールをスプレーしてから、胸郭の下のマウスの左側の皮膚と腹壁を通して湾曲したハサミと鉗子を使用して5センチの劣った切り込みを作成します。下切り傷の上部にある皮膚と腹壁を通して3センチメートルの内側の切り込みを入れます。胸郭の下のマウスの最も遠い右側の皮膚と腹壁を通る内側の切り込みの端にさらに5センチメートルの劣った切り込みを入れます。
湾曲した鉗子で腹部の皮膚皮弁を取り除くためにさらに3センチメートルの内側切開を行います。次に、横隔膜と胸骨を切り開いて心臓を露出させます。ゲージ針を心臓の左心室に挿入し、弁を回します。
湾曲したハサミで右心房を切り、血液と固定剤が心臓から出るようにします。10ミリリットルの固定バッファーでマウスを1〜2分間灌流するか、肝臓の色が薄くなり、右心房から血液が流れなくなるまで待ちます。灌流が完了したら、バルブをチューブラインに対して垂直に回して、バッファーの流れを停止します。
目を核にするには、浅いトレイからマウスを取り外し、ドラフトの吸収性アンダーパッドに置きます。次に、左目を実験者に向け、右目を視界から外して、マウスの頭を向けます。目の上側に組織マーキング染料で注釈を付けます。
眼窩から目の突出のために、親指と人差し指で眼窩の周りをそっと押し下げます。次に、湾曲したハサミを使用して、眼窩から30度の角度で刃で目を持ち、目の周りを切ります。湾曲した鉗子で頭から眼球を取り除き、吸収性のアンダーパッドの上に置きます。
11番のメスの刃で角膜をニックし、湾曲した鉗子で2ミリリットルの固定バッファーを含む2ミリリットルのマイクロチューブに目を置きます。両眼を核形成した後、固定バッファー中で4度の部屋でシェーカー上で75rpmの速度で一晩インキュベートします。翌日、固定液バッファーを2ミリリットルのPBSと交換し、室温および75rpmのシェーカー上で10分間インキュベートします。
次に、後部セグメントを生成するために、解剖顕微鏡下でPBSで満たされたペトリ皿に眼を置きます。細い先端の鉗子で脂肪や筋肉を眼球からそっと持ち上げます。眼球が均一な青みがかった黒色になるまで、マイクロ解剖ハサミで眼球と平行方向に脂肪と筋肉を慎重にトリミングします角膜穿刺部位に細い先端の鉗子を置き、マイクロ解剖ハサミで穿刺部位から始まる角膜の周囲を切断して、眼球から角膜と虹彩を取り除きます。
次に、先端の細い鉗子を使用して、眼球からレンズをそっと取り外して、後部セグメントを生成します。後部セグメントを2ミリリットルのPBSを含むチューブに入れ、使用するまで冷蔵庫で摂氏4度で保管します。PBSを含むペトリ皿に目を移し、示されているように角膜と虹彩を取り除きます。
細い先端の鉗子でレンズを引き出します。次に、先端の細い2つの鉗子を使用して、神経網膜を後部セグメントからそっと分離します。後眼カップから取り除くために、視神経乳頭の神経網膜を慎重に切断します。
アイカップを5マイクロリットルのPBSを含む2ミリリットルのマイクロチューブに入れます。後眼カップを固定するには、500マイクロリットルのメタノールを組織に加え、シェーカーで75rpmで5分間インキュベートします。メタノール固定を3回繰り返し、最終インキュベーションを2時間行います。
固定後、組織をPBSで3回洗浄した後、免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡による可視化に進みます。4ヶ月齢のTMEM 135 TGマウスは、年齢を一致させた野生型マウスと比較して、視神経から600および900マイクロメートル離れた場所で網膜色素上皮またはRPE厚さの有意な減少を示した。325日齢のWTおよびTMEM 135 TGマウスの微小血管形成、大液胞化および遊走を含むRPE病態の発生率を計算した。
RPE微小液胞化の平均頻度は、TMEM 135 TGマウスと比較して野生型で低かった。野生型では、TMEM 135 TGマウスで観察された平均値と比較して、RPEマクロ液胞化および遊走は検出されなかった。透過型電子顕微鏡では、24か月齢の網膜には基底層流沈着が観察されましたが、2か月齢の網膜には見られませんでした。
基底層状沈着物高さの累積頻度の分析は、24ヶ月齢について線の右側へのシフトを示し、2ヶ月齢と比較して、24ヶ月齢のマウスにおける沈着の増加を実証した。この観察は、生後24か月の網膜の平均身長が高いことによって裏付けられました。4ヶ月齢のTMEM 135 TGマウスにおけるRPEは異形性であった。
TMEM 135 TG網膜のRPEは、年齢が一致した野生型網膜よりも大きく、密度が低いです。また、対照と比較して、TG網膜においてより多くの多核RPE細胞が観察された。このプロトコルに従って、研究者はマウスの分子生物学的手法を使用して特定の経路を評価することができ、これらのRP病理がマウスでどのように発生するかの理解に貢献する可能性があります。
このプロトコルは、マウスのRP表現型を標準化するのに役立ち、マウス研究の知見を他のAMDモデルに変換し、AMD病態生物学の理解に役立ちます。
