WSU小動物内科サービス(ジリアン・ヘインズ博士、サラ・ゲス博士、シェリー少尉LVT)とWSU VTH臨床研究コーディネーターのValorie Wiss氏に、市民科学者(患者ドナー)からの症例募集とサンプル収集のサポートに感謝します。本研究の一部は、米国国立衛生研究所所長室(K01OD030515・R21OD031903・Y.M.A.)および日本学術振興会若手研究者海外チャレンジプログラム(202280196 to I.N.)の支援を受けて行われました。図1Aと図3Aは BioRender.com で作成しました。

イヌIBD腸内チップシステムにおける3D形態形成の確立

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

この研究は、イヌ腸オルガノイドとイヌIBD腸オンチップモデルの開発との適合性の先駆的な実証を示しています。腸管オルガノイドとオルガノイド由来の単層培養物をマイクロ流体システム(すなわち、Gut-on-a-Chipシステム)に統合することで、この技術はさらに進化し、生理学的動態を厳密に模倣し、生物学的状態をより代表する in vitro 腸モデルの作成が可能になりました。特に、ヒトにおけるIBD由来オルガノイドを用いたGut-on-a-Chip培養の報告は非常に少ないため、イヌIBD由来のGut-on-a-Chipを用いた今回の研究は、ヒトにおけるIBD研究に先駆けとなる知見を提供する可能性があります。
Gut-on-a-Chip上でイヌの腸管上皮3D形態形成を成功させるには、いくつかの重要なステップに細心の注意を払う必要があります。第1に、PDMSマイクロ流体チャネルの疎水性表面は、ECMの接着とその後の細胞接着を妨げる可能性があり、ECMコーティングと細胞播種の前にPDMSの表面活性化が必要になります(プロトコルセクション1を参照)。安定した単層培養を達成するためには、細胞接着(プロトコルステップ4.6-4.7)に続いて、過剰な未結合細胞の除去が重要です。さらに、一定の媒体の流れや蠕動運動のような真空運動などの動的刺激は、腸上皮の3D形態形成に必要です(プロトコルステップ5.2)。Gut-on-a-Chip培養のどのステップでもマイクロチャネル内の気泡を避けるためには、慎重な取り扱いが不可欠です。
Gut-on-a-Chipへの細胞播種が不十分な場合は、細胞数が少ないか、細胞の接着が不十分であることが原因である可能性があります。細胞数が少ない場合のトラブルシューティングには、調製した腸管オルガノイドのマトリゲル中での増殖を観察し、その健康状態を検査することが重要です。細胞の生存率は、細胞の20%以下が死滅していないことを確認するために、細胞解離後のトリパンブルー染色によって評価できます。生細胞数が不十分な場合は、オルガノイド培地条件の最適化を試みることができます。別の可能性として、オルガノイドの解離が不完全になり、その結果、70 μmを超える細胞塊が過剰になり、フィルターに捕捉されることもあります。これを解決するための1つの選択肢は、細胞解離中のピペッティングの期間を延長することです。あるいは、15 mLのコニカルチューブは、トリプシン様プロテアーゼによる処理を受けている間、毎分穏やかに攪拌することができます。Gut-on-a-Chipへの細胞の接着不良は、ECMコーティングが不適切であることが原因である可能性があります。コーティングプロセス中は、気泡の存在を注意深く確認し、必要に応じてコーティング液をそっと追加して気泡の形成を防ぐことをお勧めします。細胞が過密状態になり、付着していない細胞を洗い流すことができないと、初期単層が不十分になる可能性があります。このような場合、シリンジプランジャーを押すときに穏やかなパルスを加えることができます。これらのトラブルシューティング手順は、Gut-on-a-Chip培養プロセス中の問題を特定して対処するのに役立ちます。
このGut-on-a-Chipプラットフォームは、起伏のある3D上皮層の作成を可能にしますが、腸内微小環境を完全に再現するには、生物学的な複雑さがさらに必要であることを認識しています。上皮細胞と間葉系細胞の相互作用、3D再生のためのECMの沈着、および適切な幹細胞ニッチを確立する陰窩絨毛特性の存在を考慮することが重要です。線維芽細胞などの間質細胞は、ECMタンパク質の産生と腸の形態形成の調節に重要な役割を果たします34,35,36。このモデルに間葉系細胞を含めることで、形態形成と細胞接着の効率の両方を高める可能性があります。毛細血管系とリンパ管を含む内皮層は、分子輸送と免疫細胞の動員を支配する上で重要な役割を果たします37,38。患者由来の免疫細胞を含めることは、自然免疫と獲得免疫の相互作用の実証と組織特異的免疫の確立を可能にするため、腸疾患のモデル化に不可欠である可能性があります39。Gut-on-a-Chip上での3D形態形成の完了に続いて、オルガノイド培養培地をオルガノイド分化培地に修飾することができる。これは、実験の目的に応じて、追加の細胞分化を誘導するための実行可能なアプローチになる可能性があります。
3Dマイクロアーキテクチャを その場 でイメージングすることは、長い作動距離が必要なため困難ですが、長距離対物レンズで克服できます。さらに、層ごとの微細加工と接合の方法により、SEMで検査するために上層にアクセスすることが困難になります。現在のGut-on-a-Chip設計では、Gut-on-a-Chipマイクロデバイスごとに1つのシリンジポンプが必要であり、CO2 インキュベーターのスペースを占有し、大規模な実験を妨げています。ユーザーフレンドリーなプラットフォームとハイスループットスクリーニングのための拡張性を高めるには、イノベーションが必要です。
これらの現行のプロトコルにより、in vitroでの3D上皮層の自発的な発生が可能になり、従来の3Dオルガノイド、2D単層、および静的マイクロデバイス培養システムの限界を超えています。このダイナミックなin vitro腸微小環境は、多様な細胞タイプの共培養を導入することで制御できます。これまでの研究では、腸内細菌叢14,23や末梢単核細胞30の共培養など、Gut-on-a-Chip微小環境を操作する方法が検討されてきた。この再構成された微小環境は、薬物試験、基礎的な機構研究、疾患モデリングなど、多くの応用の可能性を秘めています。再構築された微小環境は、薬物検査23,40,41や疾患モデリング12,13,14,30、腸管形態形成の基本的な機構研究42など、幅広い応用に大きな可能性を秘めている。様々なアッセイは、代謝産物の評価のために上清を採取することによって43、ゲノム検査のために細胞を採取することによって2,32、または生細胞色素を用いて細胞を目視検査することによって、またはその後の免疫蛍光イメージングのために固定することによって行うことができる23,44。
この研究は、Gut-on-a-Chipプラットフォームで犬の腸上皮層の3D形態形成を開発するための再現性のあるプロトコルを提示します。その結果、3D上皮構造は腸内微小環境をよりリアルに表現することができ、さまざまな生物医学研究への応用に大きな可能性を秘めています。この腸の構造を活用することで、より多くのトランスレーショナルリサーチを行い、有望な結果をもたらす可能性があります。

腸管上皮の形態形成は、主に実験動物モデルによって研究されてきましたが、実験動物モデルはコストと時間がかかり、ヒトの発生プロセスを正確に表していません1。さらに、従来の静的な2D細胞培養モデルでは、3D上皮構造の複雑な空間構成を模倣する能力が欠けています2。その結果、腸管上皮構造の理解を進めるために、ヒト関連動物モデルの腸管上皮細胞を使用して in vitro 3D形態形成を誘導するプロトコルが必要です。
コンパニオン・ドッグは、家畜化中に環境と食事を共有していたため、腸の解剖学的構造とマイクロバイオームの組成が人間と非常によく似ています3。この類似性に加えて、人間と犬の両方に、腸の健康に起因すると考えられているさまざまな慢性的な罹患率があります。犬は、人間と同様に、肥満、認知機能障害、糖尿病、炎症性腸疾患(IBD)、結腸直腸腺癌などの慢性疾患を自然に発症する可能性があります4,5,6,7,8,9,10。以前のGut-on-a-Chip研究2,11,12,13,14でヒトおよびマウスの上皮細胞の開発と使用にもかかわらず、イヌの腸上皮はこれまで利用されていませんでした。イヌの腸管オルガノイド上皮を3D上皮形態形成の動的培養系で利用する私たちの新しいアプローチは、イヌとヒトの両方の医療に重要な意味を持ちます。
腸管オルガノイド培養の最近の進歩により、イヌ腸オルガノイド培養が確立されました15。この培養システムでは、定義されたモルフォゲンコンディショニング下で腸管幹細胞を培養し、成体幹細胞に由来する自己複製特性を持つ3Dモデルを作成します16。しかし、輸送アッセイや宿主とマイクロバイオームの共培養を行うことは、腸管腔が密閉されているため、この3Dモデルでは困難を伴います17。これに対処するために、研究者は腸管オルガノイドに由来する2D単層を生成し、内腔表面の露出を可能にしました18,19。しかし、3Dオルガノイドと2D単分子膜はどちらも静的な条件下で維持されており、腸内微小環境のin vivoバイオメカニクスを正確に反映していません。患者由来のイヌオルガノイド技術とin vitro 3D形態形成を組み合わせることで、慢性多因子疾患のトランスレーショナルリサーチの機会が得られます。このアプローチにより、研究者は人間と犬の両方に利益をもたらすより効果的な治療法を開発し、人間、動物、環境の健康の相互関連性を認識する共同アプローチであるOne Health Initiativeと連携して、トランスレーショナルリサーチをさらに進めることができます。複雑な健康課題に対処し、すべての人にとって最適な健康成果を達成するための学際的な協力を促進します。このイニシアチブは、人間、動物、生態系の相互依存性を理解することにより、新興感染症、環境悪化、およびその他の共通の健康上の懸念によるリスクを軽減することを目的としています20,21,22。
このプロトコルはpolydimethylsiloxane (PDMS)基づかせていた多孔質の膜が付いているGut-on-a-Chipのマイクロデバイス上の忍耐強いオルガノイドから得られる犬の腸の上皮細胞を培養するための広範囲な方法を概説する。イヌの腸管オルガノイドとこのGut-on-a-Chip技術を統合して3次元上皮形態形成を確立することで、腸管がどのように細胞組織と幹細胞ニッチを発達・維持しているかを研究することができます。このプラットフォームは、マイクロバイオームコミュニティが腸の健康に及ぼす影響を調査し、これらのコミュニティが腸の病態生理学に寄与する微生物代謝物をどのように生成するかを理解する貴重な機会を提供します14,23。これらの進歩は、現在、犬の腸サンプルにまで拡張することができ、研究者は腸内細菌叢と宿主の生理機能の間の複雑な関係を探求する機会を得ることができます。これにより、腸の病態生理学の根本的なメカニズムに関する貴重な洞察を得るための道が開かれ、犬と人間の健康、およびさまざまな疾患状態における微生物代謝産物の潜在的な役割を理解するための道が開かれます。イヌのGut-on-a-Chipに用いられたプロトコルは再現性があり、このアプローチにより、犬とヒトの両方における宿主とマイクロバイオームの相互作用、病原体感染、プロバイオティクスベースの治療効果を調査できるため、比較医療に適した実験モデルとなります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM, glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT30009CI</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids and organoid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>9094360</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td>2.5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells engineered to secrete Noggin&#160;</td>
			<td>Baylor College of Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 MAX Media supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1x&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>10% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 (Rspo1) cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td>Rspo1 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin-1 Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td>&#160;10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>StemCellTechnologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15 ]-Gastrin I human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td>x250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG H&#38;L labeled with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>x50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 50%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408700-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>87V Industrial Multimeter</td>
			<td>Fluke Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C170i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-103-0519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexCell FX-5000 Tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase-contrast microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8-X inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>SP8-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>model no. BS-8000 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/ozone generator</td>
			<td>Jelight Company</td>
			<td>model no. 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X imaging software&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional morphogenesis in canine gut-on-a-chip using intestinal organoids derived from inflammatory bowel disease patients

犬の腸は解剖学、微生物学、生理学において人間と類似しており、犬は自然に人間と同様の自然発生的な腸障害を発症します。腸上皮の頂端表面にアクセスする際の3次元(3D)オルガノイドの固有の制限を克服することで、オルガノイドに由来する細胞を使用してアクセス可能な管腔表面を露出させる2次元(2D)単層培養が生成されました。これらのオルガノイドとオルガノイド由来の単層培養物をマイクロ流体のGut-on-a-Chipシステムに統合することで、技術はさらに進化し、より生理学的に関連性のある動態in vitro 腸モデルの開発が可能になりました。
本研究では、炎症性腸疾患(IBD)に罹患したイヌから採取した初代腸組織サンプルを用いて、イヌ腸上皮の3次元形態形成を図るためのプロトコールを提示する。また、3D腸オルガノイド由来の細胞を用いて、2D単層培養および腸管オンチップシステムを生成および維持するためのプロトコルについても概説します。この研究で提示されたプロトコルは、犬用に特別に設計されたマイクロ流体Gut-on-a-Chipシステムを確立するための基本的なフレームワークとして機能します。この革新的なアプローチの基礎を築くことで、ワンヘルスイニシアチブの原則に沿って、生物医学およびトランスレーショナル研究におけるこれらの技術の適用を拡大することを目指しています。このアプローチを利用することで、犬とヒトの両方の腸生理学を研究するための、より生理学的に関連性のある動的 in vitro モデルを開発することができます。これは、生物医学および製薬の応用において、両種の腸疾患に対するより効果的な治療法の開発に役立つため、重要な意味を持ちます。

Intestinal epithelial morphogenesis has been largely studied through laboratory animal models, which are costly, time-consuming, and do not accurately represent human developmental processes1. Furthermore, conventional static 2D cell culture models lack the ability to mimic the complex spatial organization of a 3D epithelial architecture2. As a result, there is a need for a protocol to induce in vitro 3D morphogenesis using intestinal epithelial cells from human-relevant animal models to advance our understanding of gut epithelial architecture.
Companion dogs have developed intestinal anatomy and microbiome compositions that are remarkably similar to humans due to their shared environment and diet during domestication3. In addition to this similarity, both humans and dogs share various chronic morbidities that are thought to be attributed to intestinal health. Dogs, like humans, can spontaneously develop chronic conditions such as obesity, cognitive dysfunction, diabetes mellitus, inflammatory bowel disease (IBD), and colorectal adenocarcinoma4,5,6,7,8,9,10. Despite the development and use of human and murine epithelial cells in previous Gut-on-a-Chip studies2,11,12,13,14, canine intestinal epithelium has not been utilized until now. Our novel approach, utilizing canine intestinal organoid epithelium in a dynamic culture system with a 3D epithelial morphogenesis, has significant implications for both canine and human medicine.
Recent advancements in intestinal organoid culture have led to the establishment of canine intestinal organoid culture15. This culture system involves culturing intestinal stem cells under defined morphogen conditioning, resulting in a 3D model with self-renewing properties derived from adult stem cells16. However, conducting transport assays or host-microbiome cocultures poses difficulties with this 3D model because of the enclosed nature of the intestinal lumen17. To address this, researchers have generated a 2D monolayer derived from intestinal organoids, allowing for exposure of the luminal surface18,19. However, both 3D organoids and 2D monolayers are maintained under static conditions, which do not accurately reflect the in vivo biomechanics of the intestinal microenvironment. Combining patient-derived canine organoids technology with in vitro 3D morphogenesis presents an opportunity for translational research into chronic multifactorial diseases. This approach enables researchers to develop more effective treatments benefiting both humans and dogs and further advance translational research, aligning with the One Health Initiative, which is a collaborative approach that recognizes the interconnectedness of human, animal, and environmental health. It promotes interdisciplinary cooperation to address complex health challenges and achieve optimal health outcomes for all. By understanding the interdependencies between humans, animals, and ecosystems, the initiative aims to mitigate risks from emerging infectious diseases, environmental degradation, and other shared health concerns20,21,22.
This protocol outlines comprehensive methods for culturing canine intestinal epithelial cells obtained from patient organoids on a Gut-on-a-Chip microdevice with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membrane. Establishing the 3D epithelial morphogenesis by integrating canine intestinal organoids and this Gut-on-a-Chip technology enables us to study how the gut develops and maintains its cellular organization and stem cell niche. This platform offers a valuable opportunity to investigate the impact of microbiome communities on gut health and understand how these communities generate microbial metabolites that contribute to intestinal pathophysiology14,23. These advancements can now be extended to canine intestinal samples, providing researchers with opportunities to explore the intricate relationship between the gut microbiome and host physiology. This opens up avenues for gaining valuable insights into the underlying mechanisms of intestinal pathophysiology and understanding the potential role of microbial metabolites in both canine and human health, as well as various disease conditions. The protocol used for canine Gut-on-a-Chip is reproducible, making it a suitable experimental model for comparative medicine, as this approach enables investigation of host-microbiome interactions, pathogen infections, and probiotic-based therapeutic effects in both dogs and humans.

著者スポットライト:3D腸の形態形成研究のための犬のIBD腸内チップモデルの開発と応用 

炎症性腸疾患患者由来の腸管オルガノイドを用いたイヌ腸チップの3次元形態形成

Our research goal is to create a method for growing 3D structures using intestinal cells from animals similar to humans, specifically dogs. Intestinal cellular morphogenesis has been largely studied through laboratory animal models, which are costly, time consuming, and do not accurately represent human developmental processes. Furthermore, conventional static 2D cell culture models lack the ability to mimic the complex spatial organization of a 3D abSerial architecture.Achieving the attachment of individual cells derived from intestinal organoids onto the ECM-coated PDMS surface has posed a significant challenge. A pivotal step in addressing this challenge in both ensuring a uniform ECM coating through surface activation and allowing it to dry overnight. The integration of patient-derived canine organoid technology with in-vitro 3D Morphogenesis offers a promising avenue for conducting translational research into chronic multifactorial diseases, aligning with the One Health Initiative.The protocol for canine IBD, got on a chip, offers a replicable model for comparative medicine, enabling studies on intestinal morphogenesis, host-microbiome interactions, infections, drug and probiotic screenings, and has cross-species applicability.

このプロトコルは確実にGut-on-a-Chipシステムにおける3D腸の形態形成の自発的な開発を促進します。このアプローチでは、炎症性腸疾患(IBD)に罹患したイヌ由来の腸管オルガノイドから得られたイヌの腸管上皮細胞を利用します(図1B)。イヌ腸上皮細胞の3D形態形成の時折のクラスタリングは、6〜9日間の培地フローの後、マイクロチャネル全体で観察できます(図3C)。これらの形態学的変化は、位相差技術を使用して監視できます。この研究では、IBDと診断された2匹の犬に由来するオルガノイドを利用しました。特筆すべきは、3D形態形成の成功が2つの生物学的複製で観察され、それぞれが2つの技術的複製で実施されたことです。この研究で得られた知見は、他のイヌのドナーに由来する腸管オルガノイドに関する今後の研究の基礎となる。これらの結果は、以前にヒトサンプルで報告された実験アプローチの潜在的な適用性と再現性を示しています。これらの知見は、ヒト腸上皮細胞を用いた研究で以前に報告されたように、Gut-on-a-Chip技術がイヌの腸上皮細胞に適用できることをさらに裏付けるものです2。
このプロトコルは、従来の蛍光顕微鏡法を用いて、マイクロ流体チップに絨毛様構造を形成したオルガノイド由来単層の3D構造を評価するために免疫蛍光染色を使用できることを示しました(図4 A、B)。このプロトコルは、免疫蛍光染色によって区別され、空間的に組織された細胞表現型を検証するために適合させることができます。Gut-on-a-Chip内の3D形態形成の視覚化は、さまざまな病理学的相互作用中の宿主応答を調査する絶好の機会を提供します14,23,31。以前にヒトで報告されたように、患者ドナー由来の上皮細胞と組み合わせると、この技術を利用して腸疾患の個別化モデルを構築することができます13。免疫蛍光イメージングと蛍光in situハイブリダイゼーションなどのターゲットRNA可視化技術を統合することで、Gut-on-a-Chipシステム内で宿主のトランスクリプトームおよびプロテオームを視覚的に解析することが可能になります。
腸管の恒常性を維持するためには、腸の恒常性を維持するために腸の完全性を維持することが不可欠であり、Gut-on-a-Chipプラットフォームは、この重要な機能の正確なモニタリングと定量化を可能にすることで、貴重な利点を提供します。Gut-on-a-Chip技術を使用したTEERの測定には、いくつかの利点があります。例えば、これまでの研究で、腸内細胞を非病原菌やプロバイオティクス菌と共培養したり32したり、リーキーガット条件下でTEERを評価することに成功しています23。これにより、研究者はさまざまな状態が腸のバリア機能に与える影響を研究し、腸の健康を促進するための潜在的な介入を特定することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig01.jpg"> 図1:患者由来のイヌIBD Gut-on-a-Chipの確立。 (A)患者由来の腸管オルガノイドとGut-on-a-Chipプラットフォームの統合。内視鏡生検を実施して腸陰窩細胞を単離し、ドナー特異的な腸オルガノイドを作製することができます。上皮細胞は、オルガノイドから単一細胞に解離し、PDMSベースのGut-on-a-Chipに播種し、独自の動的微小環境で培養することができます。(B)IBD犬のコロノイドの代表的な画像。スケールバー = 100 μm。 (C)この回路図は、上部と下部のマイクロチャネルの間に配置された多孔質膜で構成されるGut-on-a-Chipデバイスを示しています。上段のマイクロ流路は青色の領域で示され、下段のマイクロ流路は赤色の領域で示されます。真空チャンバーはマイクロチャネルの両側に存在し、多孔質膜を変形させて蠕動運動24を模倣する。(d)イヌのGut−on−a−Chipのセットアップは、カバースリップ2,24上に置かれたチューブで組み立てられたPDMSベースのGut−on−a−Chipを含む。バイパスチューブは、取り扱い中(シリンジへの接続中)にマイクロチャネル内に圧力がかかるのを防ぐために重要です。バインダークリップは、チューブをクランプするために使用されます。体積に敏感な材料は、上部または下部の出口の開いた穴から注入できます。オルガノイド培養培地は、シリンジを平滑端針に接続し、上下の入口を通る流れを注入することができる。略語:IBD =炎症性腸疾患;PDMS = ポリジメチルシロキサン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig02.jpg"> 図2:イヌIBD Gut-on-a-Chipにおける絨毛様構造の形成。 解離した上皮細胞をECMでコーティングしたGut-on-a-Chipに播種しました。解離した細胞がPDMSメンブレンに付着した後、頂端流を3日間開始しました(D0-D3)。コンフルエントな2次元単分子膜が形成されると(D3)、頻繁な伸張を伴う基底側流が開始されます(伸張、AP、およびBL流)。2〜3日間のデュアルフローと膜の伸張の後、2D単層は3D形態形成を発達させ始め、9日間の培養後に絨毛様構造が形成されます(3D形態形成、D9-D12)。略語:ECM =細胞外マトリックス;PDMS = ポリジメチルシロキサン;AP =頂端;BL =基底側。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig03.jpg"> 図3:Gut-on-a-Chipにおけるイヌ腸オルガノイド播種と3D形態形成。 (A)PDMSベースのGut-on-a-Chipにおける多孔質膜の表面活性化の実験ステップ。UV/オゾン処理、PEI、GA処理を併用することで、ECM溶液中に存在するアミンの架橋が容易になります。このプロセスにより、ECMタンパク質が多孔質膜に安定的に固定化されます。(B)位相差画像は、播種直後(左)と播種後3〜5時間後(右)の細胞の形態を示しています。播種後3時間後の多孔質膜は、単一細胞が付着した部分が薄く暗い領域を示し、接着プロセスを強調しています。(C)位相差画像は、Gut-on-a-Chipシステム内の腸単分子膜の3D形態形成を示しています。これらの単層はIBDに罹患したイヌに由来し、これらのオルガノイド細胞は、流体の流れと伸張運動を含む動的条件下で12日間培養されました。スケールバー = 50 μm (B,C)。略語:IBD =炎症性腸疾患;ECM = 細胞外マトリックス;PDMS = ポリジメチルシロキサン;PEI =ポリエチレンイミン;GA =グルタルアルデヒド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig04.jpg"> 図4:患者由来のイヌGut-on-a-Chipにおける3D形態学的発達の評価。 (A)イヌIBD Gut-on-a-Chipの免疫蛍光イメージング、12日間の培養後に完全に発達した3D上皮を蛍光顕微鏡で評価した上半身のトップダウン図。タイトジャンクションタンパク質(ZO-1)は黄色で可視化されています。ブラシ境界膜(F-アクチン)は赤で表示されます。核はDAPIで染色され、青色に見えます。(B)長距離レンズ付き共焦点顕微鏡を用いたイヌIBD Gut-on-a-Chipの免疫蛍光イメージング。概略図に示されているように、12日間の培養後に完全に発達した3D上皮の絨毛様構造の断面の蛍光画像が示されている。さらに、Zスタッキングは3D上皮の側面図を示し、絨毛様構造の形成を明らかにします。ブラシ境界膜(F-アクチン)は赤色で、核はDAPIで染色されて青色で表示されます。(C)腸管バリア機能は、患者由来のイヌGut-on-a-ChipsにおいてTEERによって評価および測定されました。安定したTEER値は、Gut-on-a-Chipでの培養の5日目に達しました。エラーバーは、測定値のSEMを表します。TEER 値は、2 つの生物学的反復と 1 つの技術的反復で測定されました。スケールバー = 50 μm (A)、25 μm (B)。略語:IBD =炎症性腸疾患;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;TEER = 経上皮電気抵抗。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:イヌコロノイド由来単層およびGut-on-a-Chipデバイスにおける抗ZO-1ポリクローナル抗体の特性評価。 (A)黄色のZO-1と赤のF-アクチンの免疫蛍光染色とその重ね合わせ画像。スケールバー = 25 μm。 (B)「Leaky Gut Chips」中の黄色のZO-1の免疫蛍光可視化は、プロバイオティクス細菌(LGG+サイトカインまたはVSL#3+サイトカイン)による刺激や、プロバイオティクス刺激を伴わない無菌コントロール(サイトカイン)など、さまざまな条件下で行われました。スケールバー = 50 μm。この図は、Min et al.23 から転載したものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/FigureS1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表S1:組織ドナー情報の要約。 ドナーの年齢、性別、品種、病理組織学的評価、および犬のIBD活動性指数(CIBDAI)スコアの要約表。CIBDAI は、犬の IBD33 の臨床的重症度を推測するために使用される数値スコアリング システムです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720_SupplementTable.JoVE.Nagao%20(2).xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Application of a Canine IBD Gut-on-a-Chip Model for 3D Intestinal Morphogenesis Studies at JoVE.com

イヌ腸オルガノイドとGut-on-a-Chipマイクロ流体システムの統合により、ヒトの腸疾患に関連するトランスレーショナルモデルが提供されます。提示されたプロトコルは、腸の3D形態形成と動的 in vitro モデリングを可能にし、One Healthの犬と人間の腸疾患の効果的な治療法の開発を支援します。

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal ...

私たちの研究目標は、ヒトに似た動物、特にイヌの腸管細胞を用いて3次元構造を増殖させる方法の創出です。腸細胞の形態形成は、主に実験動物モデルによって研究されてきましたが、実験動物モデルはコストと時間がかかり、ヒトの発生プロセスを正確に表していません。さらに、従来の静的な2D細胞培養モデルでは、3D abSerialアーキテクチャの複雑な空間構成を模倣する能力が欠けています。腸管オルガノイド由来の個々の細胞をECMでコーティングされたPDMS表面に付着させることは、大きな課題となっていました。この課題に対処する上で極めて重要なステップであり、表面活性化による均一なECMコーティングの確保と、一晩の乾燥の両方を実現します。患者由来のイヌオルガノイド技術とin vitro 3D形態形成の統合は、One Health Initiativeと連携し、慢性多因子疾患のトランスレーショナルリサーチを実施するための有望な手段を提供します。イヌIBDのプロトコルは、比較医学のための複製可能なモデルを提供し、腸の形態形成、宿主とマイクロバイオームの相互作用、感染症、薬物およびプロバイオティクスのスクリーニングに関する研究を可能にし、種間の適用性を備えています。

three-dimensional-morphogenesis-canine-gut-on-chip-using-intestinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients

2.0K ビュー.  Washington State University. 私たちの研究目標は、ヒトに似た動物、特にイヌの腸管細胞を用いて3次元構造を増殖させる方法の創出です。腸細胞の形態形成は、主に実験動物モデルによって研究されてきましたが、実験動物モデルはコストと時間がかかり、ヒトの発生プロセスを正確に表していません。さらに、従来の静的な2D細胞培養モデルでは、3D abSerialアーキテクチャの複雑な空間構成を模倣...