このプロトコルで使用される動物に日々の飼育を提供してくれたダートマス大学の比較医学研究センターに感謝します。また、プロトコルのテストと動物の撮影に協力してくれたリア・ジェイコブとアドワイタ・ボーズにも感謝します。最後に、タトゥーの実践に関するトレーニングを提供してくれたAnn Millerの研究室に感謝します。この研究は、NIHの助成金R00 GM147826 to J.L.の支援を受けました。

記載されているすべての動物処置は、ダートマス大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. 機器のセットアップ
注:手順のワークフローとベンチセットアップの例が含まれています(図1)。
<ol><li>タトゥーガンとフットペダルを電源に接続します。フットペダルを作業面の下に置きます。</li>
	<li>タトゥーガンの組み立て<ol><li>六角レンチまたは六角ドライバーを使用して、グリップのネジを緩めます(図2A、赤丸で囲んだ部分)。</li>
		<li>プラスチック製の先端をグリップの奥まで挿入します。ネジを締めて所定の位置に固定します。</li>
		<li>グリップの背面に金属チューブを挿入します(図2A)。こちらは調整されますので、半分の長さに差し込んでいきます。ネジを締めて所定の位置に固定します。</li>
		<li>タトゥー針をグリップの背面に挿入して、グリップの前面にあるプラスチック製の先端に快適に収まるようにします(図2B)。</li>
		<li>針と金属チューブの背面をチューブクランプに通します。針がプラスチックの先端に快適に収まるように金属チューブを調整します(図2B)。チューブclを手で締めますamp チューブが動かなくなるまで(図2C)。</li>
		<li>黒いOリングを取り外し、針をローターアームに引っ掛けます。Oリングを元に戻して、針を所定の位置に固定します(図2C)。</li>
	</ol></li>
	<li>電源の電圧は、皮膚を貫通するのに十分な電力があるが、制御が難しいほど強力ではないように設定します。電源を接続して接続したら、フットペダルを押して、マシンが機能していることを確認します。針を自分や他の人に向けないように注意してください。 注:このプロトコルで使用されるタトゥーマシンは、6.0〜9.0 Vの間で最適に機能しますが、これはタトゥーマシンと電圧供給によって異なる場合があり、経験的に決定する必要があります。</li>
	<li>1.5 mLの微量遠心チューブまたは付属のプラスチック製インクポットのキャップに黒いタトゥーインクを入れ、約4分の3まで満たします。</li>
</ol>2.麻酔
<ol><li>1匹の成虫の雌の X.laevis カエルを沈めるのに十分な大きさのタンクで麻酔を準備します。<ol><li>カエルに安全な(塩素フリー)水を使用して、トリカインを最終濃度1.5 g / Lに、重炭酸ナトリウムを最終濃度3.5 g / Lに添加します。この溶液のpHは7.15です。 注意:トリカインは刺激物です。</li>
	</ol></li>
	<li>1匹のカエルを麻酔タンクに沈めます。カエルが麻酔されるまでトリカイン溶液に沈めたままであることを確認してください(7〜8分)。<ol><li>カエルが完全に麻酔されているかどうかを確認するには、カエルを持ち上げて逆さまに持ち、片足でしっかりと握ります。カエルがひるんだり反応したりしない場合は、入れ墨をすることができます。</li>
		<li>カエルが麻酔を受けるのに一貫して10分以上かかる場合は、重炭酸ナトリウムで緩衝した新鮮なトリカイン溶液を準備します。 注:カエルはトリカイン溶液15に30分以上費やさないでください。</li>
	</ol></li>
</ol>3.タトゥー
注:生きている動物に入れ墨をする前に、皮がしっかりした果物(レモンやバナナなど)で練習すると便利です。
<ol><li>入れ墨をする前に、カエルのための回収タンクを準備してください。タンクに10〜15Lの新鮮なカエルに安全な水を入れ、発泡スチロールのアイランドを追加します。これにより、カエルが溺れることなく目を覚ますための表面が提供されます。 注:発泡スチロールの島は、ジップトップバッグの中に入れられた発泡スチロールの冷蔵輸送コンテナの蓋を使用して作成できます。</li>
	<li>麻酔をかけたカエルを背中に乗せて、乾いたペーパータオルまたはベンチペーパーに置きます(図3A)。カエルを含むすべての作業には、無漂白(茶色)のペーパータオルを使用してください。</li>
	<li>糸くずの出ない乾いたワイプを使用して、カエルの胸から水と粘液を拭き取ります。</li>
	<li>指でカエルの胸の中央にある胸骨を見つけ、利き手ではない手を使って、皮膚をぴんと張ったままにします。</li>
	<li>カエルのマーキング<ol><li>組み立てたタトゥーガンを作業面に対して垂直に持ち、針をインクに浸します(図3B)。</li>
		<li>組み立てたタトゥーガンを垂直に保ち、針の先端をカエルの皮膚に押し付けてから、フットペダルを踏みます。カエルの肌に線を引き、圧力を均等にかけます。 注:軽度の出血や発赤は正常であり、軽度の皮膚の脱落も同様です。</li>
		<li>針がカエルの皮膚に引っかかっている場合は、ワイプで針から余分なインクや皮膚を取り除きます。入れ墨中にインクが過剰になるのは正常です。</li>
		<li>カエルの胸がインクで覆われすぎてマークされている領域がはっきりと見えない場合(図3C)、カエルに安全な水とワイプ(図3C ')で余分なインクを取り除きます。次に、ドライワイプで水分を逃がし、インクを続けます。 注:入れ墨をする前に、カエルに安全な水のスクイーズボトルを準備できます。</li>
		<li>余分なインクを拭き取った後、暗くなるまで同じ領域にインクを塗り続けます。読みやすい数字が残ります(図3D)。1回のストロークで全体のマーキングや数字を描くのではなく、特に曲線の場合は、小さなストロークを繰り返し作成します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. リカバリー
<ol><li>ペーパータオルをカエルに安全な水で濡らし、発泡スチロールの島の上に平らに置きます(図4A)。</li>
	<li>カエルを立っている水槽に戻す<ol><li>カエルの腹を下にして、水に面したタオルの上に置きます(図4B)。ペーパータオルの半分をカエルの後ろ半分に折り、カップ状の手でカエルの上部を濡らします。カエルが麻酔から出てくると(入れ墨の後約1時間)、カエルは独立して水に入り、普通に泳ぎます。</li>
		<li>入れ墨が完全に治癒したら、24時間後にカエルを長期住宅に戻します。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 清掃・設備メンテナンス
<ol><li>タトゥー針の再利用とオートクレーブ<ol><li>100%イソプロパノールと脱イオン水で針をすすぎ、インクをほぐし、溶けていない残りのインクをこすり落とします。</li>
		<li>スクラブ後、針を金属製のオートクレーブケースに入れるか、アルミホイルとオートクレーブで30分間乾燥サイクルで包みます。</li>
	</ol></li>
	<li>タトゥーマシンやその他の機器の一部にインクがある場合は、100%エタノールとペーパータオルで拭いてください。</li>
	<li>麻酔薬溶液の最終的なトリカイン濃度は約0.5%である。これは、施設の有害廃棄物管理ガイドラインに従って廃棄してください。</li>
	<li>機器の保管とメンテナンス<ol><li>可能であれば、タトゥーマシンは乾燥した部屋に保管してください。水分が多すぎると、電気部品が損傷し、機械の寿命が短くなります。</li>
		<li>タトゥーマシンを良好な状態に保つには、ローターのベアリング(図2C)をチェックして、振動22から緩んでいないことを確認します。これは、六角レンチまたは六角ドライバーで締めることができます。</li>
		<li>月に1回程度、ローターアームのベアリングに厚塗りグリース22を使用して潤滑します。</li>
		<li>タトゥーマシンによっては、ローターアームが動かなくなって振動しなくなることがあります。これを修正するには、ローターアームをひねるか、スプリングを圧縮して、針が下がった位置にくるようにします(図2C)。</li>
	</ol></li>
</ol>

両生類のマーキングの最適化:Xenopusのタトゥーのガイド

<ol>
	<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+and+humane+experimental+technique:+Implementing+change.">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals (Basel). 9 (10), 754 (2019).</li><li>Elkan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pregnancy+test.">The Xenopus pregnancy test.</a> British Med J. 2, 1253-1256 (1938).</li><li>Vize, P. D., Zorn, A. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens:+Lessons+from+zebrafish+and+Xenopus.">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).</li><li>Carron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origin+of+Hox13-dependent+skin+appendages+in+amphibians.">Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians.</a> Nat Commun. 15 (1), 2328 (2024).</li><li>Schultz, T. W., Dawson, D. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+implant+fluorescent+marker:+A+reliable+marking+alternative+for+snakes.">Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes.</a> Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).</li><li>Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+identification+methods+for+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).</li><li>Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+of+African+clawed+toads+(Xenopus+laevis).+Improvement+of+a+skin+autograft+technique.">Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique.</a> New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).</li><li>R&#246;del, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis.">Xenopus tropicalis.</a> AmphibiaWeb. , (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+Tattoo+Supply.">Worldwide Tattoo Supply.</a> Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro &amp; Maintenance. , (2015).</li><li>Khan, S. U., Mufti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hot+history+and+cold+future+of+brands.">The hot history and cold future of brands.</a> J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).</li><li>Catlett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups &amp; More. , (2019).</li></ol>

著者は、競合する利益を宣言しません。

人間を入れ墨することは何千年も前にさかのぼる芸術形式であり、人間が自分自身を入れ墨している限り、彼らは動物にも入れ墨をしたり、ブランド化したりしてきました23。動物、特に哺乳類をマーキングするための機器と技術は、十分に確立され、十分に文書化されており、広くアクセス可能です。動物にマーキングすることは、もともと家畜と盗難の抑止力を区別す?...

動物モデルは、人間の健康に関する問題を調査するための便利なツールです。実際には、動物モデルを用いた生物医学研究では、健康な動物コロニーを慎重に組織し、維持する必要があります。倫理的な動物の取り扱いと飼育のためのベストプラクティスは、実験に必要な動物の数を減らし、動物福祉を確保するための実践を洗練することを目的としています1。Xenopus laevis(X. laevis;アフリカツメガエル)とXenopus tropicalis(X. tropicalis;Western Clawed frog)は、1930年代に南アフリカの医師が最初の妊娠検査を行うためにX. laevisを使用して以来、生物医学研究に使用されてきました2。現代の妊娠検査薬ではカエルは不要になりましたが、Xenopus研究の役割は続いています。生物医学研究にXenopusを使用する利点には、よく注釈されたゲノム3、大量の卵の年間にわたる排卵誘発性4、体外受精に適した外部産卵などがあります。これらの特徴により、脊椎動物の発生学と発生学5,6,7、基本的な分子生物学と細胞生物学7,8,9,10、およびヒト疾患のモデリング7,11,12,13に有用な資産となっています。
個々のXenopus動物を追跡する信頼性の高い方法は、生物学的複製を記録し、研究の厳密性と再現性を向上させるために不可欠です。Xenopusはグループで飼育されることが多いため、動物マーキングにより、研究者は個々の動物を簡単に追跡できます4。動物の正確な記録を維持することで、時間とリソースを節約し、動物の健康状態を追跡する能力を向上させることができます。例えば、動物の個体同定は、トランスジェニックXenopus系統を作製するための組織化ワークフローを改善することができるが、これは、シーケンシング14によって検証された特定の遺伝子型を持つカエルの複数世代が必要であり、それには動物の組織化および個体同定が必要であるからである。これは、これらの突然変異が容易に識別できる成人の表現型を欠いている場合に特に当てはまります。同様に、Xenopusの卵母細胞と胚を使用して基本的な細胞生物学と発生生物学を研究することは、個々の動物を追跡することで有益です。排卵を誘発した後、動物は過排卵症候群などの健康上の合併症を防ぐために最低3ヶ月間休む必要がある15。個々の同定方法により、動物が頻繁に排卵するように誘導されないようにします。
また、動物のマーキングと追跡により、ラボの担当者は動物の健康上の懸念を追跡することもできます。同じ遺伝子型の動物が病気になるのは、導入遺伝子に関連する過度の近親交配または予期しない健康上の懸念を示している可能性があります。同様に、最近の排卵後に病気になった動物は、試薬、材料、または技術に問題があることを示している可能性があります。動物とその健康状態を追跡することで、研究所の担当者や獣医師は、懸念が再浮上したときにフォローアップし、将来の病気を防ぐための予防策を講じることができます。哺乳類では、多数の識別方法があります。マウスの恒久的な方法には、耳のパンチング、耳のタグ、入れ墨、および皮下マイクロチップ16が含まれる。これらは、コロニーやケージ内の動物を明確かつ確実に区別でき、実験室の担当者が簡単に投与できます。耳を打つなどの方法は、侵襲性が低く、特殊な器具を1つだけ必要とし、ほとんどの年齢の動物に効果があります。これらのシステムはマウスにとっては簡単で便利ですが、カエルでの使用には独自の課題があります。カエルや他の両生類には耳介(外耳の構造)がありません。一部の研究者は、動物の顎、つま先、または後肢17,18にタグを取り付けている。このアプローチは、さまざまな問題を引き起こしました:顎のタグは刺激を引き起こし、興奮したカエルは前肢でタグを引き抜こうとしました17。つま先タグがつま先の間のウェビングを貫通し、動きを妨げ、紛失するリスクを運びました。そのため、両生類は識別のために独自の方法を必要とします。歴史的に、つま先切り取りは両生類17,19をマークするためにも使用されてきました。つま先は鋭利なハサミで切り取られ、動物は前足と後足のつま先の長さ、またはつま先が元に戻った角度(サンショウウオの場合)で識別できます。しかし、この方法は、つま先の切り取りが動物の動きを損なう可能性があるという倫理的な懸念を提起します17。さらに、これは出血を引き起こし、感染のリスクをもたらす可能性があります。別の確立されたマーキングシステムは、カエルの一部から皮膚を採取し、別の部分に外科的に取り付けた皮膚自家移植です。例えば、カエルの背中または肩に、その胸部20からの明るい色の皮膚移植片を使用してカエルの背中または肩をマーキングする方法が記載されている。皮膚移植には制限とリスクも伴います:この手順は侵襲的であり、Aeromonasの親水性感染、または致命的な可能性のある赤い脚のリスクをもたらします。自家移植片の完全な治癒には最大6週間かかります。そして、記載されている方法では、自家移植片20を置く場所が限られているため、6匹のカエルしか一緒に収容できません。
侵襲性の低いマーキングアプローチには、ガラスビーズとトランスポンダチップ17,19が含まれます。ガラスビーズ法では、ガラスビーズを小さな縫合糸に通し、カエルの皮膚に縫い付けます。これにより、皮膚自家移植片よりも大きな変動性が得られ、少なくとも60の特徴的な色の組み合わせがあります。しかし、縫合糸が抜けてビーズが失われるリスクがあります。あるいは、マイクロチップトランスポンダーをカエルの背側リンパ嚢の皮下に埋め込むこともできます。これは最も永続的なマーキング方法と考えられており、潜在的に無限の数の動物を個別に識別してカタログ化することができます。ただし、個々のマイクロチップは高価であり、大きなコロニーはマーキングに費用がかかるため、これは最も高価な方法でもあります。マイクロチップは、19を読み取るために特別なスキャナも必要です。Xenopusの識別のための一般的なアプローチの1つは、動物の自然な色とパターンを参照することです。これは、X. laevisのようなカエルにとって特に効果的で、彼らは成体期を通じて明確なパターンを残します。しかし、これらのパターンはストレスによって時間とともに変化する可能性があり、カエルが透明な容器と着色された容器の間を移動すると、色が異なって見えることがある15。さらに、この同定方法は、X. laevisと比較して明確なマーキングパターンが少ないX. tropicalisや、色のマーキングがないアルビノの動物にはあまり有用ではない21。明確なマーキングを持つ種であっても、研究室の担当者はマーキングの配置とサイズを異なる方法で解釈することがあり、識別にエラーが発生する可能性があります。このため、動物の撮影は、追加の識別方法と併用すると最も信頼性が高くなります。したがって、私たちは、容易に識別でき、永続的で、低侵襲の技術を使用してXenopus動物をマークし、識別することを目指しています。
両生類の入れ墨の方法を説明する公開されたリソースは限られています。入れ墨は、熱ブランド、硝酸銀ブランド、凍結ブランド17など、他のブランディング技術と一緒に説明されています。同じリソースで、入れ墨は27G皮下注射針で数字を描くことによって行われ、そのプロセスは、数字または他のマークに形作られたワイヤーを使用した他のブランディング技術とは対照的に、感染を引き起こさないことが注目されました。別の情報源では、電気入れ墨機(振動針として説明されている)がカエルに印を付けるために使用されたが、技術についての詳細はほとんど提供されなかった17,19。著者たちは、この手順がカエルの保護スライム層を乱すことで、脚が赤くなるリスクが高まると警告している。完全に非侵襲的(写真など)と恒久的な(マイクロチップなど)の両方のマーキングや識別方法はありませんが、入れ墨は効果的な妥協点を提供します。入れ墨は、皮膚自家移植などの他の技術に比べて比較的簡単です。その他の利点には、学習曲線が小さく、機器が比較的安価であることが含まれます。水生両生類の入れ墨には特定の課題が伴い、研究者を威嚇し、成功した動物のマーキングを損なう可能性があります。この論文は、回転式タトゥーマシンで大人のXenopusを入れ墨するための十分に文書化された方法を研究者に提供することを目的としています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1203RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 Needle Round Disposable ULTRA</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>HTIPRS5-U</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1205RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1207RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Cord</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkpots</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, delicate task wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCA Connection</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scream Ink Pitch Black, 1oz</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>SI101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grips</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>STEALTH2-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam island</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the lid of a styrofoam cold shipping container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>CAUTION: IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unbleached paper towels</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2U229</td>
			<td>Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage Supply</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle (with frog-safe water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0340923T</td>
			<td>Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X. laevis adult female</td>
			<td>Xenopus1</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip-top plastic bag</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This bag should be large enough to hold the styrofoam island</td>
		</tr>
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methods for tattooing xenopus laevis with a rotary tattoo machine

動物モデルは生物医学研究の範囲を広げ、発生生物学、分子生物学、細胞生物学の理解を深め、研究者がヒトの疾患をモデル化することを可能にします。個々の動物を記録し追跡することで、研究者は研究に必要な動物の数を減らし、動物の健康を改善するための実践を洗練させることができます。哺乳類のマーキングと追跡には、耳のパンチングや耳のタグなど、いくつかの十分に文書化された方法が存在します。しかし、水生両生類の種をマーキングする方法は限られており、既存の資源は時代遅れであったり、効果がなかったり、法外に高価であったりします。この原稿では、ロータリータトゥーマシンで Xenopus laevis をマーキングする方法とベストプラクティスを概説します。適切な入れ墨は高品質の入れ墨をもたらし、研究者が個人を簡単に区別できるようにし、動物の健康へのリスクを最小限に抑えます。また、入れ墨がすぐに消えて動物に不必要な害を及ぼす可能性のある、質の悪い入れ墨の原因を強調します。このアプローチにより、研究者や獣医師は両生類に印を付けることができ、生物学的複製やトランスジェニック系統を追跡し、動物の健康状態を正確に記録することができます。

Animal models are useful tools for investigating questions pertaining to human health. In practice, biomedical research using animal models requires careful organization and maintenance of a healthy animal colony. Best practices for ethical animal handling and husbandry aim to reduce the number of animals needed for experimentation and refine practices to ensure animal welfare1. The clawed frog genus, including Xenopus laevis (X. laevis; African clawed frog) and Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Western clawed frog), have been used in biomedical research since the 1930s when X. laevis were used by South African doctors to conduct the first pregnancy tests2. While modern pregnancy tests no longer require frogs, the role of Xenopus research persists. Advantages of using Xenopus for biomedical research include their well-annotated genomes3, year-round inducible ovulation of large clutches of eggs4, and externally laid eggs amenable to in vitro fertilization. These features make them a useful asset for vertebrate embryology and development5,6,7, basic molecular and cellular biology7,8,9,10, and for modeling human disease7,11,12,13.
Reliable methods for tracking individual Xenopus animals are essential for recording biological replicates and improving rigor and reproducibility in research. As Xenopus are frequently housed in groups, animal marking allows researchers to easily track individual animals4. Maintaining an accurate record of animals can save time and resources and improve the ability to track animals&#39; health. For example, individual identification of animals can improve organization workflows for generating transgenic Xenopus lines, as this requires multiple generations of frogs with specific genotypes verified by sequencing14, which requires organization and individual identification of animals. This is particularly true when these mutations lack easily discernible adult phenotypes. Similarly, the use of Xenopus oocytes and embryos to study basic cellular and developmental biology benefits from tracking individual animals. After inducing ovulation, animals need to rest for a minimum of 3 months to prevent health complications such as hyper-ovulation syndrome15. Individual identification methods ensure that animals are not induced to ovulate too frequently.
Marking and tracking animals also enables lab personnel to track animals&#39; health concerns. Animals of the same genotype falling ill can indicate excessive inbreeding or unanticipated health concerns associated with the transgene. Similarly, animals falling ill after recent ovulation can indicate issues with reagents, materials, or techniques. Tracking animals and their health enables lab personnel and veterinarians to follow up when concerns resurface and take preventative measures to prevent future illness. In mammals, there are numerous identification methods. Permanent methods for mice include ear punching, ear tags, tattooing, and subcutaneous microchips16. These can clearly and reliably differentiate animals within a colony or cage and can be easily administered by laboratory personnel. Methods such as ear punching are minimally invasive, require only one piece of specialized equipment, and work for animals of most ages. While these systems are straightforward and useful for mice, their use in frogs presents a unique set of challenges. Frogs and other amphibians lack a pinna (external ear structure). Some researchers have attached tags to the animal&#39;s jaw, toe, or hind limb17,18. This approach resulted in various problems: jaw tags caused irritation, and agitated frogs attempted to pull off tags with their forelimbs17. Toe tags pierced the webbing between toes, impairing movement and carrying the risk of becoming lost. As such, amphibians require their own methods for identification. Historically, toe-clipping has also been used to mark amphibians17,19. The toe is clipped with a sharp pair of scissors, and the animal can be identified by the length of toes on the forefeet and hind feet or by the angle at which the toe has grown back (in salamanders). However, this method poses the ethical concern that toe clipping may impair the animal&#39;s movement17. In addition, this can cause bleeding and introduce a risk of infection. Another established marking system is skin autografts, in which skin is taken from one part of the frog and surgically attached to another part. For example, a method is described for marking a frog&#39;s back or shoulder using a light-colored skin graft from its chest20. Skin grafts also come with limitations and risks: the procedure is invasive and introduces the risk of Aeromonas hydrophila infection, or red leg, a potentially fatal affliction; complete healing of the autograft takes up to 6 weeks; and with the methods described, only 6 frogs can be housed together because of limited places to put an autograft20.
Less invasive marking approaches include glass beads and transponder chips17,19. In the glass bead method, glass beads are threaded onto a small suture and sewn into the frog&#39;s skin. This provides greater variability than skin autografts, with at least 60 distinctive color combinations. There is, however, a risk that the suture can come out and result in the beads being lost. Alternatively, a microchip transponder can be implanted under the skin in the frog&#39;s dorsal lymph sac. This is considered the most permanent marking method and enables a potentially infinite number of animals to be individually identified and cataloged. However, this is also the most expensive method, as individual microchips are expensive, and a large colony would be costly to mark. Microchips also require a special scanner to read19. One common approach for Xenopus identification is referring to animals&#39; natural coloring and patterning. This works especially well for frogs such as X. laevis, which have distinct patterns that remain throughout adulthood. However, these patterns can change over time with stress, and coloring can appear different when frogs are moved between transparent and tinted containers15. Additionally, this identification method is less useful for X. tropicalis, which has less distinct marking patterns compared to X. laevis, or for albino animals, which have no color markings21. Even for species with distinct markings, lab personnel can interpret the placement and size of markings differently, which can cause errors in identification. Because of this, photographing animals is most reliable in conjunction with an additional identification method. Therefore, we seek to mark and identify Xenopus animals using a technique that is easily discernable, permanent, and minimally invasive.
There are limited published resources describing methods for tattooing amphibians. Tattooing has been described alongside other branding techniques, including heat brands, silver nitrate brands, and freeze brands17. In the same resource, tattooing was done by drawing numerals with a 27G hypodermic needle, and the process was noted not to cause infection, in contrast to the other branding techniques, which used a wire shaped into a numeral or other mark. In another source, an electric tattooing machine (described as a vibrating needle) was used to mark frogs, but little detail was provided on the technique17,19. The authors warn that by disturbing the frog&#39;s protective slime layer, this procedure increases the risk of red leg. While there is no marking or identification method that is both completely noninvasive (such as photographs) and permanent (such as microchips), tattooing provides an effective compromise. Tattooing is relatively straightforward compared to other techniques, such as skin autografts. Additional benefits include a smaller learning curve and relatively inexpensive equipment. Tattooing aquatic amphibians comes with certain challenges, which can intimidate researchers and impair successful animal marking. This paper aims to provide researchers with well-documented methods for tattooing adult Xenopus with a rotary tattoo machine.

著者スポットライト:生物医学研究のための Xenopus laevis マーキング技術の改良

ロータリータトゥーマシンによる Xenopus laevis のタトゥー方法

Our research is focused on investigating the organization of the cell cortex using Xenopus egg extracts and supported lipid bilayers. We are trying to understand how dynamic cytoskeletal patterns are regulated within the cortex and how these patterns support basic cell functions like cell division. This protocol outlines an effective and safe method for marking Xenopus laevis.This approach enables researchers to track genetic lines and experimental replicates and to monitor animal health. Tattooing is a cost-effective permanent marking technique for amphibians. It's much less invasive than other permanent methods, such as skin graft or tags, it's also more reliable than qualitative methods, like photos or pattern recognition.

高品質の入れ墨は、カエルの胸に暗くて読みやすいストロークがあり、数フィート離れた場所から明確に区別できます(図5A)。一般に、数字やマーキングは読みやすくするために大きいほど優れていますが、長い名前や数字は、カエルの胸に快適に収まるように小さくすることができます。入れ墨の寿命を判断するのはより困難ですが、高品質のカエルの入れ墨は、少な...

ここでは、回転式タトゥーマシンで大人の Xenopus laevis (アフリカの爪のあるカエル)の入れ墨の方法について説明します。適切な入れ墨は、数ヶ月間持続し、研究や記録管理の目的で動物を簡単に区別できるようにする、暗くて読みやすい数字をもたらします。

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine

370 ビュー.  Dartmouth College. 私たちの研究は、Xenopus卵抽出物と担持脂質二重層を使用して細胞皮質の組織を調査することに焦点を当てています。私たちは、皮質内で動的な細胞骨格パターンがどのように制御されているか、そしてこれらのパターンが細胞分裂などの基本的な細胞機能をどのようにサポートしているかを理解しようとしています。このプロトコルは、Xenopus l...