私たちの研究の範囲は、主に、さまざまな悪性をより適切に治療するために、抗腫瘍活性と生体内持続性が改善されたヒトiPSC CAR NK細胞の開発に焦点を当てています。この新規CAR iPSC NK作製プロトコルにより、これらの細胞がどのようにして腫瘍の微小環境耐性を克服し、有効性を向上させ、安全でスケーラブルな生産を確保できるかを明らかにすることを目指しています。iPS細胞由来CAR NK細胞の開発における主な実験的課題は、iPS細胞を安定的かつ効率的に機能的に分化させること、副作用なく安定したCAR発現を確保すること、および生体内持続性を向上させることです。
さらに、研究者は、臨床応用のためのスケーラビリティ、免疫拒絶反応、および規制保持者という課題に直面しています。トランスポゾンを用いた遺伝子改変を用いて、効率的な非ウイルス性CAR遺伝子組換えを確立することで、iPS細胞由来CAR NK細胞の研究を飛躍的に進めました。さらに、CRISPR-Cas9をiPS細胞レベルで最適化して免疫チェックポイントを消失させ、TMA因子を改善して細胞と症例の細胞と腫瘍の有効性とinvivo持続性を固形腫瘍モデルで実現しました。
非ウイルス性ピギーバックベクター媒介CAR遺伝子発現を用いた本プロトコールにより、iPSC CAR NK細胞の安全で効率的かつスケーラブルな遺伝子改変の開発のギャップに対処することを目指しています。この方法は、挿入突然変異誘発のリスクを低減し、がん免疫療法のためのCAR NK細胞を生成する際の再現性と費用対効果を高めます。今後、当研究室では、免疫チェックポイントを標的とした新規iPS細胞由来NK細胞の開発に注力していきます。また、二重特異性抗体または三重特異性抗体を使用して、さまざまな腫瘍微小環境因子を標的とし、in vivoでの特異性、持続性、抗腫瘍活性を高めることを検討します。
スピン胚体またはEB形成継代を開始するには、MT余剰分を含む6ウェル基底膜マトリックスのコード化済みプレート内のウェルあたり約200,000のCAR iPS細胞をインキュベートし、細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素とインキュベートし、2日後に培養培地を取り出し、1ミリリットルの予熱TrypLE Selectで5分間インキュベートすることにより細胞を分離します。次に、細胞凝集体を慎重に解離して単一細胞懸濁液にし、懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。解離反応を止めるためにPBSを3ミリリットル加えます。
次に、MK SR-plus培地で細胞を再懸濁し、70μmのセルストレーナーでろ過して凝集体を除去します。細胞を遠心分離します。ペレットを5ミリリットルのPBSで洗浄し、次に1ミリリットルのEB形成媒体に再懸濁します。
カウント後、サイトカインと10マイクロモルのROCK阻害剤を含むEB形成培地を使用して、細胞を適切な密度に希釈します。マルチチャンネルピペットシードを使用して、96ウェルプレートのEB培地100マイクロリットルでウェルあたり3000〜10,000細胞をシードします。細胞を300 Gで5分間遠心分離し、5%二酸化炭素と摂氏37度で6日間インキュベートします。
胚体の品質をチェックするには、まず、EBを解離するための0.4%チキン血清を含む0.25%トリプシンを予め温めた4ミリリットルを準備します。6日後、10〜30個のEBを15ミリリットルの円錐管に移します。EBにトリプシンチキン血清溶液を加え、水浴中でインキュベートします。
分離中に EB を 3 分から 5 分ごとに 10 分間ボルテックスします。トリプシン化されたEBを数回上下に混合してピペットで固定し、完全な解離を確保します。次に、トリプシン化プロセスを停止するために5ミリリットルのPBSを追加します。
70 μメートルのセルストレーナーでセル溶液をろ過し、新しいコニカルチューブに入れます。次に、細胞を300Gで5分間遠心分離し、ペレットを3〜5ミリリットルの新鮮なEB培地に再懸濁します。カウント後、典型的なEBマーカーで細胞を染色します。
100 μLのフローバッファーに分離したEBの単一細胞を含む各チューブに推奨量の抗体を加え、氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞をフローバッファーで2回洗浄します。SYTOXブルー生デッド染色を添加し、フローサイトメトリー解析を用いて解析します。
まず、6ウェルプレートの各ウェルに5〜10マイクロリットルの2%滅菌ゼラチン溶液をコーディングします。プレートを摂氏37度で2〜4時間インキュベートします。インキュベーション後、残りのゼラチン溶液を吸引し、ゼラチンでコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに、サイトカインを含むナチュラルキラーまたはNK分化培地を3ミリリットル加えます。
次に、1ミリリットルのピペットを使用して、人工CARI細胞iPS細胞に由来するスピンEBを10cmディッシュに慎重に移します。サイトカインを含む3ミリリットルのNK分化培地を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。1ミリリットルのマイクロピペットを使用して、16〜20個のEBを6ウェルプレートの各ウェルに分配し、5%二酸化炭素と摂氏37度で3〜4週間インキュベートします。
インキュベーション後、浮遊細胞上のフローサイトメトリーにより、NK細胞マーカーCD45陽性およびCD56陽性の発現を評価します。浮遊細胞の80%以上がCD45陽性およびCD56陽性を発現する場合。細胞を70マイクロメートルのフィルターに通して細胞を回収し、塊を取り除きます。
人工抗原提示細胞またはNK細胞内の人工APCを共培養する前に、人工APCに100グレーを照射し、凍結茎として保存します。NK細胞を回収した後、1ミリリットルあたり50ユニットのインターロイキン-2およびインターロイキン-15を添加したNK増殖培地で、10の5倍/ミリリットルの5細胞の累乗で培養します。融解した人工APCをNK細胞に1対1の割合で添加し、5%の二酸化炭素と摂氏37度でインキュベートします。
まず、フローサイトメーターの電源を入れます。抗GPC3 CAR iPS細胞由来NK細胞上でのNK活性化受容体の発現を評価し、CARケース細胞の活性と成熟状態を決定します。Caspase-3/7アッセイ用。
GPC3 CAR iPSC由来NK細胞の標的細胞をカウントし、CellTrace Violet色素でPBSの最終濃度5マイクロモルで、光保護下で摂氏37度で15分間事前に染色します。CAR iPS細胞由来NK細胞と共培養する前に、染色ターゲット細胞を完全培地で洗浄し、摂氏37度のさまざまなエフェクター対ターゲット比で行います。3時間30分の共培養の後。
Caspase-3/7緑色検出試薬を添加し、さらに30分間インキュベートします。染色の最後の5分間にSYTOX死細胞染色液を加え、穏やかに混合します。フローサイトメトリーを使用して染色した細胞を解析します。
GPC3 CAR改変IPCからのスピンEBの形成は、6日目に観察されました。早期の差別化を確認。GPC3 CAR IPCから分化したナチュラルキラー細胞またはNK細胞は、3日目から28日目までのさまざまな段階で異なる形態を示しました。
フローサイトメトリー解析では、造血抗原CD34およびCD31の発現、および野生型およびGPC3 CAR iPS細胞由来スピンEBの両方で、造血抗原CD34およびCD31、および少量のCD43の発現が示されましたが、まだ発現していません。ケース特異的なマーカーは、GPC3 CAR iPSC由来NK細胞の成熟野生型で35日目に検出されました。NK細胞への分化が成功したことを確認。
拡大した野生型および抗GPC3 CAR iPS細胞由来のNK細胞は、様々な活性化マーカーを示し、NK細胞の成熟を示しました。GPC3抗原の発現は、フローサイトメトリーを用いて腫瘍細胞株で確認され、抗GPC3 CAR iPS細胞由来NK細胞の標的特異性が検証されました。抗GPC3 CAR iPS細胞由来NK細胞は、野生型iPS細胞と比較して、HepG2、SNU-449、CAL 27、SKOV3細胞株を発現するGPC3に対して高い細胞傷害活性を示しました。
