바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

요약

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

초록

염색질의 immunoprecipitation (칩)은 살아있는 세포의 염색질의 DNA와 다른 단백질의 상호 작용을 결정하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 예를 들면 시퀀스 특정 DNA 결합 전사 인자, 히스톤과 다른 수정 상태와 같은 RNA 중합 효소와 보조 인자와 같은 효소와 DNA 복구 구성 요소를 포함. 그 편재에도 불​​구하고, 소재 모두 벤치 준비 및 상호 작용의 정량적 측정을 허용 정확한 분석을위한 최신 상세한 방법론의 부족이있다. 정보의 부족으로 인해, 또한 어떤 면역 침전과 같은 조건이 실험 조건의 새로운 집합에 대해 다시 최적화해야하기 때문에 칩의 분석은 부정확하거나 잘못 정량 결과에 감염 될 수 있습니다.

우리의 프로토콜은 궁극적으로 전사 인자에 정액 일에서 파생됩니다 DNA 상호 작용 ^{1,2,하지만} sensiti에 개선의 번호를 통합하기 어려운 얻을 세포 유형에 대한 VITY 및 재현성. 프로토콜이 성공적으로 사용되어왔다 ^3,4, DNA 농축을 정량화하기 qPCR에 사용하거나, 아래의 프로토콜의 반 정량적 인 변형을 사용하여 두.

PCR 증폭 물질이 정량적 분석은 계산 수행 및 분석에 제한 요소를 나타냅니다. 중요한 컨트롤 및 기타 고려 사항에 따라 변경을 표시하지 않는 등 연구중인 단백질 (또는 예상에 구속되지 않도록 예측 intergenic 지역으로 이소 타입을 맞춘 항체의 사용뿐만 아니라 게놈 DNA의 제어 영역의 평가를 포함 실험 조건). 또한, 모든 칩 샘플에 대한 입력 자료의 표준 곡선은 실험 물질에 농축의 절대 수준을 도출하는 데 사용됩니다. 표준 곡선의 사용에 관계없이 설계하는 방법을주의 깊게의 프라이머 세트 사이에 계정의 차이를 고려하고, 또한 효율이 다를 수 있습니다하나의 프라이머 세트에 대한 템플릿 농도의 범위에 걸쳐 ences. 우리 프로토콜은 우리가 광범위 나중에 분석 단계를 포함한다는 점에서 ^5-8 사용할 수있는 다른 사람과 다른 것입니다.

프로토콜

1. 마우스 비장 나이브 CD4의 분리는 세포를 T

1. 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜과 일치하는 인간적인 방식으로 마우스를 희생. 비장을 해부하고 10 % FBS와 DMEM 10 ML을 포함하는 페트리 접시에 넣습니다.
2. 비장 세포를 분리하기 위해 두 개의 유리 슬라이드의 서리로 덥은 끝을 사용하여 비장을 분쇄. 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
3. 4시 5 분 200 XG (일반 로터 직경 임상 원심 분리기에 대한 ~ 1,200 RPM)에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C.
4. 2 ㎖ ACK 버퍼를 Resuspend 세포는 적혈구, 실온 (RT)에서 1 분을 용해합니다. FBS와 DMEM의 13 ML을 추가하여 반응을 중지합니다.
5. 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C.
6. DMEM 포함 FBS 5 ML에있는 세포를 resuspend을하고 70 μm의 메쉬 필터 (BD 팔콘, 고양이 # 352350)를 통해 전달합니다. 세포를 계산하고 진행순진 CD4의 분리에 대한 제조 업체의 지침을 사용하여 CD4 분리 키트 (있는 Miltenyi, 고양이 # 130-095-248)를 사용하여 세포가 T. 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 순진 CD4 T 세포를 수집 ° C. FBS와 DMEM 10 ML에있는 세포를 resuspend을.

2. 염색질의 준비

1. DMEM에 세포 현탁액을 1 %의 최종 농도 37 % 포름 알데히드를 추가하고 부드럽게하는 가교 DNA 15 분 동안 RT (예 Nutator 사용)에서 록 : 단백질 복합체.
2. 125 mm의 최종 농도 1 M 글리신을 추가하여 가교를 중지합니다. RT에서 5 분 바위를 계속합니다.
3. 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C.
4. 얼음처럼 차가운 PBS 포함하는 단백질 분해 효소 억제제 5ml에 현탁하여 세포를 씻으십시오. 3 회 총 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 단백질 분해 효소 억제제 씻어 4에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C.
5. 1 ML에있는 세포를 resuspend을단백 분해 효소 억제제를 포함하는 얼음처럼 차가운 세포 용해 버퍼입니다. 15 분 동안 얼음에 품어. 세포 용해의 효율은 0.4 % 판 블루 용액에 세포의 작은 나누어지는 현탁 (시그마, 고양이 # T8154)와 현미경으로 관찰하여 확인할 수 있습니다.
6. 4시 5 분 200 XG (보통 ~ 1,200 RPM)에서 원심 분리하여 핵을 수집 ° C. 조심스럽게 상층 액을 버린다.
7. 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 핵 용해 버퍼 500 μL의 핵 resuspend을. 15 분 동안 얼음에 품어.
8. 출력 레벨 4, 15 초 버스트, 얼음 4 회 : Misonix의 Sonicator 3,000 프로브 크기 1.6 mm를 사용하여 세포를 초음파 처리. 각 시료는 시료의 과열을 방지하기 위해 다시 sonicating 전에 1-2 분 동안 얼음에 냉각해야합니다. 과열 상호 링크의 반전을 일으킬 수 있습니다.
9. 4에서 5 분 16,000 XG (의 microcentrifuge에서 ~ 13,200 RPM)에서 초음파 처리 염색질을 원심 분리기 ° C.
10. 분명 supern의 20 μL 나누어지는을atant, DNA 로딩 염료를 추가하고 2 % 아가 로스 젤 (대부분의 응용 프로그램에 대한 초음파 처리 DNA의 이상적인 크기입니다 200-500 BP)를 통해 전기로 초음파 처리 DNA를 확인합니다.
11. UV 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 결정합니다. 전단 염색질은 염색질 immunoprecipitation의 반응을 설정하기 위해 즉시 사용 또는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 일반적으로 우리는 마우스 당 2-3 X 10 ⁶ 정화 CD4 T 세포 7.5-10 μg의 DNA를 얻을 수 있습니다.

3. 염색질의 immunoprecipitation (모든 단계 0-4에서 수행해야합니다 ° C)

1. 단백 분해 효소 억제제 칩 희석 버퍼 ㎍ / ㎖ 5-10의 DNA 농도 (총 부피 = 1 ML)에 초음파 처리 염색질을 희석.
2. 입력으로 100 μL (10 %)을 저장합니다. 얼음에 저장합니다.
3. 나누어지는 450 μl의 이소 타입 제어 (마우스 또는 토끼 IgG의)과 그 항체로 분류 두 개의 1.7 ML의 microfuge의 튜브에 각각. 같은 이소 타입의 여러 항체를 사용하는 경우, 하나의 이소 타입의 contr를OL이 분석을 수행하기에 충분합니다. 다른 동물의 소스 또는 이소 타입의 항체를 사용하는 경우 여러 이소 타입 컨트롤이 필요합니다.
4. 2-5 사용되는 항체의 특이성에 따라 특정 항체 μg, 또는 각각의 튜브에 이소 타입 컨트롤을 추가합니다.
5. ° C가 염색질 항체 복합체의 형성을 할 수 있도록 4에서 하룻밤 Nutator을 사용하여 튜브를 바위.
6. 상기 혼합물에 단백질 G 자석 구슬 (정지 구슬 1:1 슬러리)의 25 μl를 추가하고 4시에 최소한 2 시간 동안 흔들 수 있습니다 ° C. 우리의 공급 업체로부터 구슬을 직접 사용할 수 있습니다.
7. 자기 스탠드에의 microfuge 튜브를 놓고 구슬은 자기 측에 수집 할 수 있습니다.
8. 조심스럽게 구슬을 방해하지 않고 흡인하여 솔루션을 제거합니다.
9. 낮은 소금 세척 용액 1 ㎖를 추가하고 부드럽게 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 자기 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. 한 번 반복합니다.
10. 염분 세척 용액 1 ㎖를 추가하고 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. 한 번 반복합니다.
11. 염화 리튬 세척 용액 1 ㎖를 추가하고 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. 한 번 반복합니다. LiCl을의 사용은 구슬 비 특정 크로 마틴 상호 작용의 효과적인 제거를 향상시킵니다.
12. TE 용액 1 ㎖를 추가하고 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거.
13. 용출 버퍼 250 μl를 추가하여 구슬에서 DNA를 용출. 실온에서 15 분 동안 바위. 용출액을 피펫하고 새로운 1.7 ML의 microfuge의 관이 물질을 저장합니다. 한 번 더 반복하고 elutions 둘을 결합한다. 구슬을 폐기하십시오.
14. 상호 링크가 최종 0.3 M의 농도와 RNase의 1 μL (20m에 5 M NaCl을 추가 역방향 용출 된 DNA에 대한 G / ML). 볼륨을 500 μl를 만드는 단계 3.2에서 저장된 입력에 용출 버퍼 400 μl를 추가합니다. 입력에 0.3 M,의 RNase A, 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 M 트리스 - 염산 산도 6.5의 20 μL와 단백질 분해 효소 K (20 밀리그램 / ML) 1 μL의 10 μL의 1 μL에 NaCl을 추가합니다.
15. 건조 가열 블록에 65에서 하룻밤 튜브 ° C를 품어. 샘플, 인감의 증발을 방지하거나 오프닝에서 그들을 유지하기 위해 튜브에 무게를 배치합니다. 하이브 리다이 제이션 오븐도 사용할 수 있습니다.
16. RT로 냉각 튜브를 할 수 있습니다. 1 ML 100 % 에탄올을 추가하고 -80에서 2 시간 - 밤새 품어 ° C 침전물 DNA합니다.
17. 펠렛에 15 분 DNA 16,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 70 % 에탄올과 공기 건조 펠렛 한 번 DNA 펠렛을 씻으십시오. 멸균 증류수 100 μL의 DNA 펠렛을 resuspend을.
18. 용출 버퍼 50 μl의 총 볼륨 QiaQuick 스핀 컬럼 및 용출을 사용하여 DNA를 정화. 이 DNA는 PCR을 위해 사용할 수 있습니다.

PCR 반응 (모든 단계는 얼음에서 수행해야 함) "> 4. 준비

1. 칩 및 해당 입력 샘플에서 모든 DNA 샘플을 수집합니다. 또한, PCR 시약 및 대상 지역의 프라이머뿐만 아니라 제어 영역을 모두 수집합니다. "hotstart"DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소를 사용합니다. 우리는이 절차에서 DNA 증폭을 정량화하기 SYBR 녹색 기반 분석을 사용하지만, qPCR에 mastermix 키트는 필요한 경우 사용할 수 있습니다.
2. 의 qPCR 분석 표준 곡선을 생성하기 위해 입력 DNA의 시리얼 희석을 예 : 10 %, 1 %, 0.1 % 및 용출 버퍼의 0.01 % (단계 3.18에서 QiaQuick 스핀 컬럼부터)합니다. 이 표준 곡선 템플릿 집합의 농도 범위와 증가는 칩 농축의 기대 수준에 따라 달라질 수 있습니다, 등 (Genemate, 고양이 # T-3182-1 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 입력 DNA 샘플의 10 μl를 분배 ), 중복합니다.
3. 각각의 10 ㎖ 칩 이소 타입 컨트롤에서 DNA뿐만 아니라 특정 항체를 분배우물, 세중합니다.
4. 대상 프라이머 또는 컨트롤 프라이머 (각 프라이머의 0.1 μM 최종 농도) 중 하나를 포함하는 "마스터 믹스"를 확인하고 각각의 우물에 10 μl를 분배. 예를 들어, 아래 템플릿에 혼합 함유 우물에 대상 뇌관은 녹색으로 표시된 마스터를 분배하고 빨간색으로 표시된 우물에 컨트롤 프라이머 마스터 믹스를 분배.
5. 우물의 바닥에 모든 것을 수집하는 RT에서 1 분에 대한 임상 원심 분리기 (~ 1,200 RPM)에서 500 XG에서 광학 플라스틱 바다 표범 어업 필름과 원심 분리기와 PCR 플레이트를 커버.
6. PCR 반응을 시작합니다. 우리는이 예제에서 qPCR에를 실행하는 LightCycler 480 II (로슈) 운영하기 LightCycler 480SW 1.5 소프트웨어를 사용합니다.

미리 배양 : 1 사이클 : 95 ° C / 5 분.

증폭 : 40-45주기 : 94 ° C / 5 초, 60 ° C / 5 초, 72 ° C/10 초 (온도가 녹는 그리고 온도보다 2-3 ° C이어야한다 어닐링프라이머 E).

용융 곡선 : 1 사이클.

냉각 : 1 사이클.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

10 % 입력

10 % 입력

이소 타입

특정

B

1 % 입력

1 % 입력

이소 타입

특정

C

0.1 % 입력

0.1 % 입력

이소 타입

특정

디

0.01 % 입력

0.01 % 입력

E

10 % 입력

10 % 입력

이소 타입

특정

에프

1 % 입력

1 % 입력

이소 타입

특정

지

0.1 % 입력

0.1 % 입력

이소 타입

특정

H

0.01 % 입력

0.01 % 입력

녹색 : 대상 지역 프라이머를 사용합니다.

빨간색 : 제어 영역 프라이머를 사용합니다.

5. 분석

1. DNA의 절대 양의 정량화 프로그램의 qPCR 소프트웨어입니다. 중요한 것은, 알 수없는 구체적이고 이소 타입 샘플 보간 DNA 금액에 표준 곡선의 사용 평가와 모든 프라이머의 품질과 효율성의 매칭이 샘플에서 발견 농도의 범위에서 설정 할 수 있습니다. 게다가, 그것은 또한 MOR를 제공합니다전자 usingΔΔCq 및 관련 방법보다 최종 상대 배 농축 결과에 Cq와 (C _T 또는 C _P) 값을 변환하는 신뢰할 수있는 방법.
2. 샘플 편집기로 가서 자신의 표준 곡선 값으로 다양한 희석의 입력 샘플을 (10 %, 1 %, 0.1 % 및 0.01 %)를 포함하는 우물을 표시합니다. 또한 PCR 플레이트가 배치되어 정확히 알 수없는 칩 샘플 우물 레이블을 지정합니다. 다른 qPCR의 기계에 사용되는 해당 소프트웨어에서 각 프라이머 쌍, 표준 곡선 값과 그에 따라 실험 이소 타입 컨트롤 샘플에 대한 반응에 해당하는 하위 집합을 지정합니다.
3. LightCycler 소프트웨어에서 집합 편집기에 가서 입력 샘플 우물뿐만 아니라 미지의 칩 샘플을 포함하는 하위 집합을 표시합니다. 미지 시료는 분석을 위해 입력 샘플의 알려진 농도에서 생성 된 표준 곡선을 사용하여 정량화 할 것입니다. 다른 qPCR의 기계에 사용되는 해당 소프트웨어를 지명 한 집합 corresp의각 프라이머 쌍에 대한 모든 반응에 onding.
4. PCR 증폭이 완료된 후, "애비 Quant/2nd 파생 최대"로 분석을 수행하고 분석하고 확인을 누르 하위 집합을 선택합니다. 다른 qPCR의 기계에 사용되는 해당 소프트웨어의 각 부분 집합에서 DNA 양에 Cq와 값을 변환합니다.
5. 입력 샘플의 알려진 농도를 사용하여 표준 곡선을 생성하고 미지 시료에서 DNA 존재의 절대 양을 표시하는 "계산"을 누릅니다.
6. 전단 DNA의 품질이 좋은 경우 프라이머가 대상 영역에 구체적으로 바인딩하는 경우, 그리고 PCR 효율은 가까운 2 있어야합니다.
7. 가능한 경우, 동일한 하위 집합 "Tm 값이 호출"을 용해 곡선 분석을 수행합니다. 하나의 피크는 하나의 특정 제품이 증폭되었음을 나타냅니다. 특정 DNA의 증폭은 아가로 오스 겔을 통해 DNA 사다리와 함께 PCR 제품을 electrophoresing하여 테​​스트 할 수 있습니다.
8. 로 데이터 내보내기 탭추가 분석을 위해 Microsoft Excel에서 열 수있는 구분 된 텍스트 파일,.
9. Microsoft Excel을 사용하여 대상 프라이머의 이소 타입 컨트롤에 특정 항체 DNA 양을 나눕니다. 제어 영역 프라이머에 대해이 단계를 반복합니다. 같은 이소 타입의 여러 항체가 서로 다른 immunoprecipitations 사용하는 경우, 같은 이소 타입 컨트롤에서 값으로 이들 각각을 정상화. 여러 대상 프라이머 쌍을 사용하는 경우 또한, 단일 제어 프라이머 쌍 세트의 DNA 수량은 각 목표 (그림 1 및 2)의 정상화를 위해 사용되어야한다. 출력 값이 아닌 특정 항체 배경 면역 침전을 기준으로 각 위치에서 특정 항체 면역 침전 배 농축을 나타냅니다.
10. 에 상대적으로 농축를 얻기 위해 제어 영역 프라이머의 배 농축 (제어 이소 타입하기)를 대상으로 프라이머의 배 농축 (제어 이소 타입 위하여) 분할컨트롤 언 바운드 영역 (그림 1). 중요한 때문에 각 샘플에 대한 총 입력 DNA, 표준 곡선의 생성 위의 immunoprecipitation의 값을 각각의 표준 곡선에서 이미 정상화되어 보간, 다음과 같이 표현주의, 머신 소프트웨어에 의해 총 입력의 비율.
11. 면역 침전이나 세정에 사용되는 버퍼의 엄중가 너무 높은 경우, 이소 타입 컨트롤에서 증폭 샘플이 관찰되지 않습니다 immunoprecipitated 동안 특정 항체 immunoprecipitated 샘플에서 강력한 증폭이 관찰 될 가능성이 있습니다. 이러한 시나리오에서는 대상 지역과 언 바운드 영역 모두에 대한 항체 칩에서 이소 타입 제어 칩의 양을 빼는 것이 좋습니다. 상대 농축 언 바운드 영역 (그림 3)에 대한 차이에 의한 대상 지역의 차이를 나누어 계산 될 수있다.

결과

염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로토콜은 따라서 "로드 관리"역할, 게놈의 언 바운드 영역을 증폭 프라이머 쌍의 사용을 통해 PCR에 사용되는 DNA의 양 (있는 경우), 차이 여기에 컨트롤을 선보였다. 그림 3의 예제에서, 우리는 대상 영역으로 마우스 IL2 발기인에 대한 관심과 전사 인자 NFAT 바인딩 사이트의 우리의 단백질 지역 언 바운드로 마우스 Actb 유전자의 코딩 ?...

토론

프로토콜은 위에 정확하게 칩을 사용하여 기본 림프구의 DNA 농축을 정량화하는 강력한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 안정성에 대한 하나의 주요 이유는 생물학적가 복제를 포함합니다. 위의 프로토콜은 세 가지가 독립적으로 계산되는 농축을 복제합니다. 출력은 다음 농축과 변화의 측정을 제공하기 위해 계산 된 표준 편차의 정도를 제공하기 위해 평균한다. 각 샘플은 세 가지 기술은 또?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Table of Equipment