임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

요약

여기에서 우리는 무작위 microseed 매트릭스 심사하는 일반적인 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 크게, 단백질 결정화 스크리닝 실험의 성공률을 높일 최적화에 대한 필요성을 감소시키고, 데이터 수집 및 리간드 침지 실험에 대한 결정의 안정적인 공급을 제공하기 위해 도시된다.

초록

랜덤 microseed 매트릭스 스크리닝 (rMMS)는 종 결정은 임의의 화면에 추가되는 단백질 결정화 기술이다. 결정이 단백질의 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성을 증가시켜, 여분 결정화 리드 종종 생성 된 결정의 질이 향상 될 수 있고, 수득되며, 데이터 수집 및 침지 실험 결정체가 잘 공급이 제공된다. 여기에서 우리는 손으로 또는 96 - 웰 또는 24 웰 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 앉거나 매달려 드롭 증기 확산 실험 중 하나에 적용 할 수있다 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명합니다.

서문

페루 츠, Kendrew 및 구조 게놈 컨소시엄의 현대 높은 처리량 자동화 된 파이프 라인에, 헤모글로빈과 미오글로빈의 구조를 결정하는 동료에 의해 초기 응용 프로그램에서 고분자 X-선 결정학은 우리에게 단백질의 세계에 전례가없는 구조 살짝 여유있다 . 이 기술은 원자에서 단백질 구조의 직접적인 시각화를 허용하는 가장 널리 적용 실험 방법 유지하거나 (즉, 1-3 Å 범위) 해상도 원자 근처. 단백질에인가하는 X-선 회절을위한 전제 조건은 우선 결정화되어야한다는이며 회절 방법 ^{1, 2에} 의한 구조 분석에서 단일 최대 속도 - 제한 단계 유지 프로세스의이 단계이다. 트립 단백질 결정화 과정의 이해 및 결정화 화면의 품질 및 유용성에 큰 개선에 상당한 발전에도 불구하고,트레이 및 관련 기술, 그것을 확실하게 결정화 성공 ^3의 가능성을 예측하는 것은 여전히 불가능하다. 생화학 및 생물 물리학 적 방법이 관심을 표시하는 단백질은 결정 핵 생성과 성장에 유리한 특성, 즉, 잘 접힌, 균질, 단 분산 등의 여부를 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다, 그러나, 어떠한 방식으로 이러한 분석은 결정의 최종적인 예측을 제공 성향.

시드는 오랫동안 존재 결정 또는 결정 성 물질 ^4-7의 숫자, 크기 및 품질을 향상시키기위한 가능한 방법으로 사칭되었다. 이 방법은 결정 핵 생성을 지원 조건이 후속의 결정 성장 및 그 반대를위한 최적이 아닐 수 있다는 전제에 기초한다. 다른 하나의 조건에서 핵 물질을 이동하여, 하나는 효과적으로 이러한 프로세스를 분리하는 새로운, 아직 미개척 결정화 공간에 따라서주는 접근을 시도 할 수 있습니다결과적으로 스크리닝 실험의 성공률을 증가시킬 수있다. 정해진 방법은 일반적으로 예를 들어 사용하는 지향성 압력의인가에 의해 얻어진 (I) macroseeding 다른 ⁸ 개의 조건에서 그 전체 단결정의 이동, (II)을 연속 시드, 핵 물질의 이동, 문서화 된 새로운 결정화 드롭 ^9, 그리고 (iii) "고전적인"microseeding 통해 수염의 후속 통과 한 다음 기존 결정의 표면에 고양이의 수염은, 수확에 의해 생성 된 결정 "씨앗"의 전송 결정 (또는 결정을 분쇄 씨앗 ^10를 산출하는 것과 유사한 조건에 자료). 특히 이러한 방법의 세 가지 확실히 현대 액체 처리 결정화 로봇과 달성 가능한 비교, 시간과 제대로 확장됩니다. 이러한 요소는 인식에, 적어도 어떤 수준에 기여하는 씨앗ING는 다른 접근이 결실을 맺기에 실패한 경우에만 방문 할 수있는 방법입니다.

임의의 행렬 microseeding (rMMS)는 높은 처리량 검사 및 확장 성을 ^{11 ~ 13} 그 전통 microseeding의 장점을 결합하여 최근의 방법 론적 혁신입니다. 이 방법은 표준 96 - 조건 결정화 화면 내의 각 sub-well/coverslip에 /로 분주 할 수있다 유핵 결정 성 물질에서 생산 된 종자 주식의 생성에 의존합니다. 이 방법은 두 손으로 또는 24도 또는 96도 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 증기 확산 실험을, 앉아 또는 교수형에 적용 할 수있다. rMMS 크게 결정화 성공률을 증가시키고, 더 큰 회절 질 및 ^{양으로 18, 13, 14의} 결정을 생성하기 위하여 실험적으로 증명하고, O에 접근 결정 학자 '병기 혁신적인 공구를 나타내고있다결정화 성공을 향한 노력을 ngoing. 여기에서 우리는 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명하고이 기​​술의 효과를 보여주는 샘플 데이터를 제공합니다.

프로토콜

1. 전략적 고려 사항

1. microseeding 실험에 사용되는 종자 결정의 선택은 실험의 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 프로젝트의 시작 부분에 크리스탈 최적화를 위해 다른 시작 지점을 제공 할 수있는 몇 가지 결정 히트를 찾기 위해 도움이됩니다. 상질 결정 교란 다음 또는 시스템이 평형 상태로 복귀 핵화 곳 영역 즉 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성이 있으므로 rMMS 크게 결정 최적화의 필요성을 감소시킨다. 따라서 우리는 첫 번째 결정이 (즉시 최초의 결정이 성장 정지로, 더 정확하게, 또는) 얻을 수있다로 정기적으로 즉시 rMMS을 사용하는 것이 좋습니다.
2. rMMS의 초기 라운드, 시드 콘텐츠는 극력 결정질 재료로 만들어 져야한다. 하나의 잘 사용할 수있는 경우 그 결정을 포함, 또는 결정이 작은 경우, 다수의 반복을 설정하는 것이 도움이 될 수 있습니다결정의 공급을 증가하는 (시드 제외) 원본 히트. 그러나, 여러 가지 히트를 얻을 수 있으며, 경우, 종자 결정은 몇 가지 조건에서 수확과 함께 혼합 할 수 있습니다.
3. 상 분리를 방지하기 위해, 높은 염 조​​건에서 성장 된 결정을 높은 PEG 조건에서 성장 된 결정 별도로 수확한다. 여러 우물에서 결정이 혼합되어있는 경우, 소금 결정을 줄 가능성이 적습니다 저장 솔루션은 씨앗 서스​​펜션을 선택해야합니다. 예를 들어, 인산염, 황산염, 칼슘, 마그네슘의 고농도는 피해야한다.
4. 나중에 프로젝트는, 회절을 향상 한쌍으로 결정을 피하고, 리간드 결합에 적합한 결정을 얻기 위해 서로 다른 단위 세포와 결정을 찾기 위해 중요 할 수있다. 이 단계에서 (예를 들면 최선을 회절하는 것) 가장 적당한 결정 시드 재고를 확인하는 데 사용되어야한다. microseeding의 반복을 라운드는 여기서 만 "최고, 필요"결정은 다음 라운드에 씨앗 주식을 만드는 데 사용됩니다. 가능하면,"이러한 PEG 3000 중립 "침전제는 새로운 결정 연락처를 장려하기 위해 높은 불안정 할 수 있습니다 단지를 구체화 할 수있는 종자 결정을 중지하는 데 사용되어야합니다 소금 솔루션 ^12.
5. 하나의 결정화 조건을 사용하는 고전 microseeding 실험은 유망한 조건의 후속 최적화 동안 식별 다음 종종 도움이된다. 그것은 드롭 당 결정의 원하는 번호를 얻기 위하여 종자 스톡을 희석하는 것이 필요하다. (증가 희석의 씨앗 주식의 일련의 결정화 조건에 추가됩니다) "조합"microseeding 실험 씨앗 주식의 최적의 희석을 찾기위한 빠른 방법입니다. 이 방법은 아래에 설명된다.

2. 시드 재고 준비

1. 분젠 불꽃을 사용하여 유리 파스퇴르 피펫으로부터 둥근 유리 프로브를 만들.
   1. 부드러운 될 때까지 중간 근처 피펫을 가열 한 후 신속하게 불에서 제거하고 끝을 따로 잡아 당겨 끌어. 아래 0.25 mm 이하의 직경 유리를 당겨하는 것을 목표로하고 있습니다.
   2. 이 약 0.25 mm이며, 간단히 화염에 깨진 끝을 뛰어 점에서 유리 휴식. ~ 825 mm의 직경이 단부에 형성되어있는 유리의 반구 때까지 이것을 반복한다. 이 적절하게 0.01 ~ 1.0 mm의 규모에 단단한 물체에 부딪혀서에 맞는 크기와 그것이 결정 트레이 하위 잘 또는 커버 슬립의 플라스틱 표면을 손상하지 않는 한이 프로브는 결정 성 물질을 분쇄하는 데 유용합니다. 결정이 유리와 플라스틱 사이에 갇혀 있기 때문에 큰 프로브 (~ 1.0 mm)를보다 효율적으로 작은 결정을 분쇄 할 수 있습니다.
2. 얼음에 시드 비드를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 배치합니다.
3. 쌍안 현미경 또는 결정 촬상 시스템을 이용하여 미리 설정된 결정화 트레이를 검사하고, 하나 이상의 AP를 선택시드 재고 세대를위한 결정 자료를 수확되는 트레이에서 우물와 적합한. 모든 물질은 미세 바늘, 구정, 미결정 및 불규칙한, 잘못 구성된 결정을 포함하여 사용 할 수 있습니다. 구형 물질이 부분적으로 가교 결합 될 가능성 같이 시드 콘텐츠는 따라서 시드 실험에 사용하기위한 그것의 적합성을 줄여, 가능한 빨리 결정 성장 정지 후에 만​​들어 져야한다. 의심은 수확 될 결정질 재료가 잘은 UV 형광 현미경 또는 이미징 시스템 전에 개구 행을 사용하여 가시화 될 수 있고, 또는 결정 성 물질은 인 - 시튜 X-선 회절 분석을 실시 할 수있다 염 또는 단백질인지에 존재하지 않으면 트레이. UV 조사하에 형광 것이다 갑 접근법 단백질 결정을 사용하는 경우, 염 결정은 무색 나타날 것이다.
4. 잘 선택한 결정 트레이를 엽니 다. 96 - 웰 주위에 상단 플라스틱 밀봉 시트를 잘라 드롭 트레이에 앉아에 대한 USI 잘 선택메스의 칼날을 겨. 24 잘 매달려 드롭 용지함 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 커버 슬립을 반전하고 안정된 깨끗한 표면에 놓으십시오. 저장 용액 50 μl를 제거하고 튜브에 걸쳐 얼음에 남아있는 것을 보장 시드 비드를 포함하는 microcentrifuge 관에이 액체를 전송합니다.
5. 철저하게 현미경으로 결과를보고, 2.1 절에서 제조 된 유리의 프로브를 사용하여, subwell (96 - 웰 트레이) 또는 커버 슬립 (24 웰 트레이)에 떨어진다 결정을 분쇄. 작은 결정은 철저하게 분쇄하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 이 단계는 실험자 결정들은 염 결정되지 않는 것을 또한 분쇄하기 쉽기 때문에, 가교되지 않으며, 확인 할 수있다. 소금 결정은 듣고 그들이 분쇄 할 때 느낄 수있는 특유의 클릭을 생산하고 있습니다. 결정은 신선한 재료를 획득하고 사용하는 시도를 분쇄하기 힘든 어려운 경우.
6. 씨 구슬 튜브와 t의 저장 용액의 5 μl를 제거를 ransfer에 해당하는 하위 아니라 (드롭 실험에 앉아), 또는 커버 슬립 (낙하 실험을 거는) 수확되는 결정 성 물질을 포함한다. 가능한 한 하위 잘 또는 커버 슬립 내용의 많은 부분을 재현 탁이 액체 위아래로 5 ~ 6 시​​간을 피펫. 씨 구슬 튜브에 서스펜션을 반환하고 많은 결정 물질을 가능한 한 수확하는 것이 보장, 두 번 더이 단계를 반복합니다.
7. 얼음에 튜브를 냉각하기 위해 매 30 초 정지, 2 분 씨 구슬을 소용돌이.
8. 4 각 단계에서 10의 요인에 의해 저장 솔루션의 씨앗 주식을 희석, 희석 시리즈를 확인합니다. 일반적으로, 너무 많은 결정을 희석 씨의 주식을 사용할 때 얻을, 잘 당 결정의 수를 제어하기 위해 희석 씨의 주식을 사용합니다. 씨앗의 농도보다 더 결정화 히트 수득되기 때문에 rMMS의 첫번째 라운드에서는, 시드 원​​액을 희석하지 않는 것이 중요하다.
9. 그것은 즉시 주를 사용할 수없는 경우ately, -20 ° C에 씨앗 주식 서스펜션과 희석 씨의 주식을 전송하거나 저장 -80 C 냉장고 °. 작은 양 분량 씩, 즉 10 ~ 20 μL에이 물질을 저장, 씨앗 주식의 효능을 감소시킬 수있는, 반복 동결 - 해동 사이클을 방지합니다. 냉동하면 필요할 때까지, 씨앗 주식은 무기한으로 유지 될 수있다.

3. 결정화 트레이 설립

1. 결정화 설비와 실험자의 환경의 상황에 따라, rMMS 결정화 스크리닝 앉아 드롭 기상 확산법을 이용하여 걸려 드롭 기상 확산법을 이용한 24 - 웰 트레이, 또는 96 - 웰 트레이를 사용하여 수행 될 수있다. rMMS위한 결정화 트레이 로봇 디스펜서 처리 액체, 또는 둘의 조합을 이용하여, 손으로도 설정 될 수있다.
2. 손으로 설정 전형적인 rMMS 실험, 1.0 ㎕의 단백질 용액, 1.0 ㎕의 결정화 조건을 포함하고합니다0.5 ㎕의 씨앗의 주식. 결정화 로봇을 사용하여 설정 전형적인 실험은 0.3 ㎕의 단백질 용액, 0.2 ㎕의 결정화 조건, 0.1 ㎕의 씨앗 주식을 포함 할 것이다.
3. 24 웰 드롭 트레이 걸려 rMMS 검사를 수행하려면, 첫째, 수동 피펫을 사용하여, 4 × 24 웰 pregreased 결정의 각 웰에 10 ㎖ 단일 튜브 형식의 96 - 웰 조건 결정화 화면에서 각 조건의 300 μl를 전송 트레이.
   1. 모두 전면과 후면 보호 역행 스트립 제거 된 해당 플라스틱 커버 슬립의 표면에 각각 300 ㎕의 저수지에서 각 결정화 조건의 양도 1 μL.
   2. 각 결정화 조건의 1 μL로 결정 씨앗 주식의 0.5 μL 다음에 단백질 용액 1 μl를 추가합니다. 액체의 드롭 하향 잘 적절한 위에 위치되도록 각 coverslip에 전환.
   3. 아래로 coverslip을 눌러, seali를 압축그리스를 겨 안전한 실을 형성한다. 일단 96 방울을 설립, 트레이는 일반적으로 스토리지에 대한 범위 4-18 °의 C에서 인큐베이터 또는 일정한 온도의 방에 전송해야합니다.
4. 96 - 웰 드롭 트레이는 먼저 각각의 결정화 트레이 잘 대응에 깊은 우물 블록 형식의 96 - 웰 조건 결정화 화면에서 각 조건의 20 ~ 50 μl를 전송 앉아 rMMS 검사를 수행합니다. 이 전사 공정은 8 - 채널 피펫을 사용하여 결정화 로봇 또는 수동 전송로를 사용하여 수행 될 수있다.
   1. 손으로 또는 3.1에 ​​설명 된 볼륨을 사용하여 로봇 방울로 전송 저수지, 단백질과 씨앗 주식 솔루션을 제공합니다. 일부 상용 결정화 로봇은 분배를 접촉하지 않고, 이러한 시스템을 사용하여 성능의 씨앗 주식 전송 조언, 관련 배관 분배의 막힘의 원인이 될 수 있습니다. 분배의 순서는 변수 : 일부 로봇은 동시에 모든 솔루션을 분배. 면다음 주식을 배정 저수지 후, 최초의 단백질을 분배 이것은 불가능합니다.
   2. 로봇을 분배 접촉 무딘 바늘로 장착되어 낮은 볼륨 유리 주사기를 사용하여 씨앗 가능한 전송되지 않습니다. 각 드롭에 씨앗 주식을 분배 저장 솔루션을 통해 전달하여 바늘을 씻어.
   3. 투명 밀봉 시트를 사용하여 트레이를 밀봉하고 인큐베이터 또는 저장을위한 일정한 온도의 방에 전송할 수 있습니다.

4. 결정화 트레이의 검사

1. 쌍안 현미경 또는 수정 이미징 시스템을 사용하여 모든 결정화 실험을 시각화. 전자는 일반적으로 뷰 깊이 이상의 사용자 큰 제어 및 후자보다 배율 수준을 수득하지만, 더 많은 시간이 걸린다.
2. 순서대로 각 sub-well/coverslip를 검사하고 수정 형성의 증거를 기록. 실험마다 24 설립 다음 5 일 동안 시간과 검사해야N 이후에 한 번, 최대 4 주 동안 매 7 일마다.
3. 최적의 회절 품질 결정이 생성되기 전에 rMMS의 여러 사이클은 종종 필요합니다.

결과

rMMS 실험 (A) 예

rMMS 검사의 효과를 입증하기 위해 우리는 암탉의 달걀 흰자위 라이소자임 (HEWL)과 소 간 카탈라제 (BLC)의 결정화에이 방법을 적용했다. 이 효소는 저명 결정화하고 구조적으로 잘 대상 ^{(15, 16)를} 특징으로 두. 등 모두 rMMS로 달성 향상된 결정화 성공률을 설명하기 위해 우수한 시험 과목을 제공하기 때문에. 결정화 실험은 96 - 웰 액체 처리 로봇을 사용하여 ...

토론

본 논문에서 우리는 rMMS 단백질 결정화 검사에 대한 일반적인 방법을 설명했다. 우리는이 방법을 사용하여 두 개의 테스트 단백질 결정화 성공률에 상당한 향상을 사용하여 증명하고있다. rMMS 비 rMMS 방법을 사용하여 생성 된 결정의 서브 세트의 방사광을 사용하여 회절 ^분석은 이전의 저자는 좋은 품질 결정 rMMS 실험 ^11에서 성장할 가능성이있는 것으로보고되었지만, 방법을 사용...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0