제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화

요약

선천성 면역 반응은 병원체의 감염에 대한 유기체를 보호합니다. 타고난 면역 반응의 중요한 구성 요소, 식세포 호흡 버스트, 침입 미생물을 죽이는 활성 산소를 생성한다. 우리는 타고난 면역 반응이 화학적으로 유도 될 때 생성 된 활성 산소 종을 정량화 호흡 버스트 분석에 대해 설명합니다.

초록

식세포 호흡기 버스트는 병원균 감염에 대한 선천성 면역 반응의 일부이며, 반응성 산소 종 (ROS)의 생성을 포함한다. ROS는 독성이 phagocytized 미생물을 죽이는 기능을한다. 식세포 유래 ROS의 생체 정량화 강력한 타고난 면역 반응을 탑재 할 수있는 유기체의 능력에 관한 정보를 제공합니다. 여기서 우리는 식세포 호흡 버스트의 화학 유도에 전체 제브라 피쉬 배아에 ROS의 양을 비교하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 활성 산소에 의한 산화에 따라 형광이되는 비 형광 화합물을 사용한다. 개인 제브라 피쉬 배아는 마이크로 플레이트의 웰에 피펫과 호흡 버스트의 화학 유도 유무에 관계없이이 형광 기판에서 배양된다. 각 웰의 형광 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 원하는 시점에서 정량화한다. 형광 판독이 배경 형광을 제거하도록 조절하고 공동 아르짝 t-검정을 사용하여 mpared. 이 방법은 서로 다른 발달 단계에와 단백질의 최저, 과발현 또는되는 약물과 치료로 실험 조작에 대한 응답에있는 제브라 피쉬 배아의 호흡 버스트 잠재력의 비교를 할 수 있습니다. 이 방법은 또한 어른 지브라 피쉬의 신장 및 다른 어류로부터 해부 전체 신장 또는 세포 제제의 호흡 버스트 응답을 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 우리는이 프로토콜의 상대적 단순성과 적응성이 기존의 프로토콜을 보완하고 더 나은 타고난 면역 반응을 이해하고자 연구에 관심이있을 것이라고 믿는다.

서문

타고난 및 적응 면역 : 면역 시스템은 두 가지로 구성되어 있습니다. 선천성 면역은 진화 적으로 적응 면역보다 더 고대합니다. 척추 동물은 모두 타고난 및 적응 가지를 가지고 반면, 무척추 동물은 현재 만 선천성 면역을 것으로 생각됩니다. 적응 면역은 특정 병원체에 대한 구체적이고 오래 지속되는 면역을 부여하면서, 선천성 면역은 침입 한 세균, 바이러스, 곰팡이에 즉각적인 반응이다. 타고난 면역 반응의 중요한 측면은 외국 침략자를 침몰하고 파괴하는 식세포 (예를 들어, 대 식세포, 호중구)의 염증과 모집 결과 사이토 카인과 케모카인의 방출을, 포함한다.

성공적인 선천성 면역 반응은 포함 : 침입하는 미생물의 (1) 인식, 적절한 신호 폭포 (사이토 카인과 케모카인의 예를 들어 릴리스)의 것 (2) 유도, 식세포의 (3) 적절한 개발 / 적절한 번호, (4) 감염의 사이트에 식세포의 이동, 병원균 (5) 말림, 그리고 가득 채우고 미생물 (6) 파괴. 다음 단계 중 하나의 결핍에 의해 압도되는 호스트로 이어질하고, 감염에 굴복 할 수 있습니다. 이 모든 식물과 동물의 병원균에 대한 방어의 첫 번째 라인 때문에 강력한 선천성 면역 반응은 생명체의 건강에 매우 중요합니다. 척추 동물에서, 또한 적응 면역 반응 ¹ potentiates. 따라서, 우리는 더 잘 이해하고 그 기능을 최적화하기 위해 선천성 면역 반응의 모든 측면을 평가할 수있는 것이 중요하다.

대부분의 모델 생물은 Arabadopsis에서 C.에 이르기까지, 선천성 면역을 연구하는 데 사용됩니다 배양 된 인간 세포로 쥐에 초파리에 엘레. 선천성 면역을 연구하기 위해 제브라 피쉬 (다니오 rerio) 모델 시스템을 사용하는 장점은 제브라 피쉬는 타고난 및 적응을 모두 메신저로, 척추 것입니다지역 사회, 그러나 타고난 및 적응 면역의 발전은 시간적으로 분리됩니다. 적응 면역이 완전하게 작동 될 때까지 제브라 피쉬는 약 4-6 주 포스트 ^{수정이 발생하는} 단독 감염에 대한 보호를 위해 선천성 면역에 의존하고 있습니다. 유전자 조작, 광학 선명도와 급속한, 외부 개발을위한 도구뿐만 아니라, 제브라 피쉬 배아 방어의 원칙 모드로 선천성 면역은 생체 내에서 타고난 면역 반응의 복잡성을 연구하는 단순화 된 모델을 제공합니다.

다중 프로토콜은 제브라 피쉬 배아 선천성 면역 반응의 다른 측면을 평가하기 위해 개발되어왔다. 마이크로 어레이 및 RNAseq는 제브라 피쉬의 타고난 면역 반응에 의해 유발 사이토 카인의 프로파일은 인간의 그것과 유사하며 또한 선천성 면역 ^3,4 예상치 못한 유전자의 참여를 제안했다고 확인했다. 제브라 피쉬 배아 및 형광, transgen의 투명도병원균 및 제브라 피쉬의 IC 균주는 실시간으로 생체 내에서 동적 호스트 병원체 상호 작용을 시각화 할 수 있습니다. 호중구 별 폐장 내 myeloperoxidase 프로모터 ^5,6 또는 대식 세포의 특정 MPEG1 발기인 ^7의 제어하에 GFP를 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬 배아 시각화하고 정량화 식세포의 이동을 지역화 감염 ^8의 사이트뿐만 아니라 식균 작용과 파괴를 시각화하는 것이 가능하게했다 찬란 ^8,9는 병원균 표시. 제브라 피쉬 배아는 높은 처리량 분석 및 화학 화면의 생성에 순종합니다. 따라서, 감염 ^(10)과 화학적으로 유도 부상 ^11의 사이트에 식세포의 이동에 따라 사체 분석의 높은 처리량 방법은 최근에 개발되었다.

위에 나열된 기술, 아무도 정량적 식세포에 의해 병원균 파괴의 마지막 단계를 평가하지 않습니다. 이 마지막 단계침몰 병원균을 죽일 호흡 버스트 (즉, 활성 산소의 생산 및 기타 독성 화합물)을 포함한다. 효소 NADPH 산화 효소는 식세포에서 ROS의 주요 원천입니다. 산소에 대한 전자의 전달에 NADPH 옥시 다제 효소 결과의 서브 유닛의 조립, 수퍼 옥사이드 음이온을 발생시킨다. 후속 효소 반응을 통해, 과산화물은 과산화수소 및 차아 산 (도 1a)로 전환 될 수있다. 그것은 병원균을 죽이기 때문에, 제브라 피쉬 배아의 호흡 버스트 가능성의 정량화가 전체 선천성 면역 건강을 나타내는 식세포의 호흡 버스트입니다. 우리는 개인의 제브라 피쉬 배아 ¹² 개에서 호흡 버스트를 정량화 할 수있는 형광 기반의 분석을 개발했다. 이 분석은 시판, 세포 투과성 염료의 비 형광, 환원 된 형태를 사용합니다. 이 염료, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein 디 아세테이트 (H2DCFDA가)로 변환된다 fluores산화시 센트 화합물, 2 ', 7'-dichlorofluorescein (DCF). 식세포 호흡 버스트에 의해 생성 된 다양한 ROS는 H2DCFDA을 산화 및 형광 ^(24)를 생성 할 수 있습니다. 형광의 외형 지브라 피쉬의 그룹 사이 호흡기 버스트 반응을 정량화하고 비교하는데 사용될 수있다. 단백질 키나제 C 효능 포르 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)는 화학적으로 활성 산소를 생산하는 NADPH 산화 효소를 유도하고, 따라서 형광 판독 (그림 1B)를 증가하는 데 사용됩니다. 여기서, 우리는이 제브라 피쉬 배아 호흡 버스트 분석의 수정 및 최적화 된 버전에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 분석은 시간이 지남에 및 / 또는 실험 조작 (예를 들어, 모르 폴리 노 - 매개 단백질 최저)에 대한 응답으로 개별 제브라 피쉬 배아의 그룹 간의 호흡 버스트을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 사용은, 다른 제브라 선천성 면역 분석법과 함께, 복잡하고 중요한의 더욱 완전한 그림을 제공 할 것이다타고난 면역 반응.

프로토콜

1. 제브라 피쉬의 관리 및 유지 보수

1. 축산 질량 스폰 성인 제브라 피쉬는 이전에 ^13을 설명했다. 이전 ¹⁴ 기술로 만들어지는 배아를 수집합니다.
2. 미세 주입은 (원하는 경우) : 같은 유전자 제품을 과다 발현하는 유전자의 제품의 mRNA를 넉다운하는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드와 Microinject 1-4 세포 단계의 제브라 피쉬 배아 이전 ^{15 설명했다.}
   1. 모의의 적절한 풀을 유지 컨트롤을 주입 (최소 48 생활, 모의 실험적으로 조작 물고기는 96 웰 마이크로 플레이트를 채우기 위해 필요한 제어 물고기 48 생활을 주입).
3. 배아를 유지 : 달걀 물에 28 ° C에서 깊은 배양 접시에있는 배아를 성장 원하는 발달 단계 (호흡 버스트 응답이 제브라 피쉬 배아에이 프로토콜을 사용하여 검출되지 때까지 (60 ㎍ / ㎖의 인스턴트 오션 바다 소금 물을 멸균 증류수) 젊은 2 일 이상)이 수정 ^(12)을 배치한다. 참고 :이 O를하고있다1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 (PTU) 또는 golden/slc24a5 돌연변이 제브라 피쉬의 사용 중 하나를 통해 제브라 피쉬 배아에 색소 침착을 방지하는 것은 상당히 PMA (출판되지 않은 데이터, 48, 72에서 테스트 배아 및 (96)에 의해 형광의 유도를 변경하지 않습니다 bserved HPF).
   1. 플라스틱 전송 피펫 매일 죽은 태아를 제거합니다.
   2. 조심스럽게 오래된 달걀 물을 가만히 따르다 매일 새로운 계란 물을 보충한다.
4. Dechorionate 배아 : 실험의 날, 같은 dechorionate 배아 (배아가 chorions하고 있으면) 이전에 두 개의 미세 집게 ¹⁴ (이 호흡 버스트 분석은 성인 제브라 피쉬 ^(12)와 신장에 대한 자세한 프로토콜에서 해부 신장에서 수행 할 수를 사용하여 설명 성인 제브라 피쉬에서 해부 이전) ^{(16, 17)을} 설명 하였다.

2. 솔루션 준비

1. H2DCFDA의 재고 솔루션을 준비 : H2DCFDA의 1 MG를 달다.
   1. 디1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 만드는 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 1 ㎖의 H2DCFDA ssolve 한 MG.
   2. 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브에이 원액 22 μL 씩 분주합니다.
   3. 알루미늄 호일에 H2DCFDA 원액의 분취 량을 감싸고 때마다 H2DCFDA 민감한 가볍기 때문에 가능한 한 어두운 곳에서 보관하십시오.
   4. 최대 3 개월 -20 ° C에서 보관 H2DCFDA 분량 씩.
2. 주의 - 포르 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)의 주식 솔루션을 준비 : 적절한 개인 보호 장비 (즉, 장갑, 고글, 마스크)를 사용하여 PMA의 1 MG를 달다.
   1. 1 ㎎ / ㎖의 원액을 만들기 위해 DMSO의 1 ㎖에 PMA를 녹입니다.
   2. 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브에 11 ㎕의 분취 량을 확인합니다.
   3. 최대 3 개월 -80 ° C에서 PMA 원액의 저장 분취.
3. H2DCFDA의 작업 솔루션을 준비 : 실험 당일, 1 1 부 H2DCFDA 주식 솔루션을 추가하여 H2DCFDA 작업 솔루션을부품 DMSO (500 ㎍ / ㎖의 H2DCFDA 최종 농도). 예를 들어, H2DCFDA 원액의 20 μl를 추가하고 호일에 20 μL의 DMSO 1.7 ML microcentrifuge 관을 감쌌다.
4. PMA의 작업 솔루션을 준비 : 실험 당일, 무료 물 (20 ㎍ / ㎖의 PMA 최종 농도) 클레아 제 49 부 1 부 PMA 주식 솔루션을 추가하여 PMA 작업 솔루션을합니다. 예를 들어, 1.7 ML microcentrifuge 관에 490 μL 클레아 무료 물에 10 μL의 PMA 원액을 희석.
5. H2DCFDA의 투약 솔루션을 준비 : 실험 당일, 달걀 물에 1 ㎍ / ㎖의 H2DCFDA의 최종 농도 H2DCFDA 투약 솔루션을합니다. 투여 용액의 제조 볼륨은 원하는대로 개질 만, 시약의 최종 농도가 유지되도록 할 수있다. 신장의 경우, 대신에 계란 물, (페놀 레드없이 50 % DMEM, 50 % F-12) 둘 베코의 수정 이글의 medium/F-12의 동일한 볼륨을 사용합니다. H2DCFDA 5 ㎖를 만들려면솔루션을 투약, 원뿔 원심 분리기 튜브 호일에 싸여 'H'라는 15 ㎖에 5 계란 ㎖의 물 (또는 DMEM/F-12)를 전송하기 위해 5 ㎖ 혈청 피펫을 사용합니다.
   1. 원뿔 튜브가 'H'표시 및 폐기 15 ML에서 계란 물 (또는 DMEM/F-12)의 10 μl를 제거합니다.
   2. (이 볼륨은 48 배아 또는 신장 샘플 (전체 96 웰 마이크로 플레이트의 절반 충분하다) 혼합하는 'H'와 소용돌이 표시된 15 ML 원뿔 관에 H2DCFDA 작업 용액 10 μl를 추가하고 이러한 우물 수준의 측정을 제공합니다 배경 형광).
6. H2DCFDA + PMA의 투약 솔루션을 준비 : 실험 당일의 최종 농도 H2DCFDA + PMA 투약 솔루션입니다 : H2DCFDA - 1 ㎍ / ㎖ 및 PMA - 400 겨 / ㎖를. , H2DCFDA + PMA 투약 용액을 5 ㎖을 'H + P'라는 새로운 15 ML 원뿔 관에 5 계란 ㎖의 물 (또는 DMEM/F-12)를 전송하기 위해 5 ㎖ 혈청 피펫을 사용합니다.
   1. _ (110)를 제거합니다6, 원뿔 튜브 '는 H의 +의 P'라는 폐기 15 ML에서 계란 물 (또는 DMEM/F-12)의 L.
   2. H2DCFDA 작업 용액 10 μl를 추가 한 다음 표시된 15 ML 원뿔 관 'H의 +의 P'와 혼합하는 소용돌이 (이 볼륨은 48 샘플 또는 전체 96 웰 마이크로 플레이트의 다른 반쪽에 충분한에 PMA 작업 용액 100 μl를 추가 ).
7. 얼음 투약 솔루션을 유지합니다.

3. 마이크로 플레이트 리더 프로그램

1. 마이크로 플레이트 리더에 힘 : 장비를 준비합니다.
   1. 광원을 따뜻하게.
   2. 예를 들어, 흥분 : 형광 읽을 수있는 프로그램 설정 485 nm의, 방출 : 528 nm의, 광학 위치 : 최고 510 nm의, 감도 : 65, 이전까지의 5 초 흔들어 단계를.

4. 96 웰 마이크로 플레이트 세트 업 (그림 2 참조)

1. 물품을 수집합니다 dechorionated 배아, 블랙 96 웰 마이크로 플레이트, P200의 피펫과 함께 요리를 얻팁, H2DCFDA 및 H2DCFDA + PMA 투여 솔루션과 얼음 양동이, 멀티 채널 P200의 피펫, 두 멸균 저수지, 알루미늄 호일, 가위.
2. 96 웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 전송 한 배아 이용 가위 피펫 팁을 절감 할 수 있도록 개방을 통해 적합 배아 또는 신장.
   1. 원하는대로 (이 각각 다른 용 피펫 팁을 변경할 필요가 없습니다 100 μL에 P200의 피펫을 설정하고 검은 96 웰 마이크로 플레이트의 웰의 많은에 계란 물 (또는 DMEM/F-12)와 함께 하나의 배아를 전송 배아 실험 조건 내에서 샘플 만) 실험 조건 사이의 팁을 변경해야 할 수 있습니다. 이 수집 한 데이터를 왜곡하는 경향, 잔류 chorions 묻지 않도록해야합니다. 신장의 전송을 위해, (100 μL로 설정) 큰 부피 피펫이 사용될 수 있고, 필요한 경우 피펫 팁은, 큰 내경을 얻기 위해 절단 될 수있다. 그것은 배아 또는 신장 샘플없이 우물을 통합 할 필요가 있지만, 함께 할 수 있습니다일부 실험 조작에 대한 제어 투약 솔루션을 제공합니다.
3. 투약 솔루션을 추가 멸균 25 ML 저수지에 H2DCFDA 투약 솔루션을 붓는다.
   1. 동시에 96 웰 마이크로 플레이트 (H2DCFDA 500 NG / ML 최종 농도)에 하나의 컬럼에 H2DCFDA 투약 용액 100 μl를 피펫하는 멀티 채널 P200의 피펫 여덟 팁을 사용합니다.
   2. (일반적으로 여섯 열 또는 48 우물은 전체 96 웰 마이크로 플레이트를 작성하는 경우) 원하는만큼 열이 (팁을 변경하는 것은 필요하지 않다)를 반복합니다. 제어 배아 샘플 및 실험적으로 조작 배아 샘플의 절반의 절반에이 솔루션을 추가 (예를 들어 96 웰 마이크로 플레이트가 설정 그림 2와 같다,이 우물 (컬러 오렌지) PMA로 유도하지 샘플에서 배경 형광 데이터를 제공 할 것입니다) .
   3. 새로운 멸균 25 ML 저수지에 H2DCFDA + PMA 투약 솔루션을 붓는다.
   4. 멀티 채널 P200의 피펫과 simult 여덟 팁을 사용하여aneously (팁을 변경하는 것은 필요하지 않습니다, H2DCFDA-500의 NG / ML 및 PMA-200 NG / ML의 최종 농도)를 96 웰 마이크로 플레이트의 (그림 2 색 레드) 나머지 열로 H2DCFDA + PMA 투여 용액 100 μl를 피펫 .
4. 알루미늄 호일로 마이크로 플레이트를 커버.
5. 물론 각각의 솔루션을 균질화 150 rpm에서 약 20 초 동안 마이크로를 흔들어.
6. 읽은되지 않을 때 28 ° C에서 마이크로 플레이트를 품어.

5. 형광 정량

1. 한번에 마이크로 알아 = 단계 3.1.2에서 설명한 매개 변수를 사용하여 PMA의 첨가 후 0 시간.
   1. 측정에게 원하는 시간 간격에 대한 몇 분 간격으로 촬영을 계속하거나 나중에 지점까지 28 ° C에서 호일 포장 마이크로를 배양 한 후 (예 : 4 시간 PMA의 첨가 후) 원하는 시간에 엔드 포인트의 측정을 수행.
2. 플라스틱 (T)를 사용하여우물에서 배아를 검색하기를 ransfer 피펫.
3. 당신의 동물 관리 및 사용 프로토콜, tricaine의 MS222의 예를 들어 침수에 따라 배아를 안락사.
4. 생물학적 폐기물 용기의 마이크로 및 기타 처분 할 수있는 재료를 폐기하십시오.

6. 데이터 분석

1. 당신이 형광 값 (PMA, 표 1을 추가 한 후 예를 들어, 4 시간)을 비교하고 싶습니다되는 시점을 결정합니다.
2. 개인 PMA 유도 제어 그룹의 형광 값의 평균 않은 유도 제어 그룹의 형광 값을 뺍니다.
3. 과와 PMA없이 실험 그룹에 대해이 단계를 반복합니다.
4. 이 열 제어 + PMA 기 및 실험 + PMA 군 (표 2)에 이러한 정규화 된 형광 값을 저장한다.
5. 컨트롤 + PMA의 GROU의 정규화 된 형광 값에 대한 수단과 표준 편차를 계산p와 실험 +의 PMA 그룹.
6. (표 2) 통계적 중요성을 결정하기 위해 짝 t-검정을 사용하여 표준화 된 형광 값을 비교한다.
7. 그래프 컨트롤 + PMA 그룹과 해당 표준 편차를 반영하는 오차 막대와 실험 + PMA 그룹의 수단.
8. 그래프와 그림 전설의 유의 수준 (그림 2)를 기록합니다.

결과

여기에, 우리는 48에서 제브라 피쉬 배아에서 호흡 버스트 응답 (야생 형, AB 배경을) 비교 데이터를 72 시간 포스트 수정 (HPF)를 제공합니다. 우리의 통제 그룹과 우리의 실험 그룹과 72 HPF 배아로 행동 48 HPF의 배아. 사용 된 표본의 크기는 24 유엔에 의한 배아 발달 단계 당 24 PMA에 의한 배아했다. (상대 형광 단위 (RFU)에서) 천연 형광 판독 값을 4 시간 PMA의 첨가 후 마이크로 플레이트를 판독함으로써 ...

토론

식세포의 기본 기능은 병원균을 감지 침몰하고 파괴하는 것입니다. 적절한 호흡 버스트를 생성하는 식세포의 능력은이 기능을 위해 중요하다. 따라서, 호흡 버스트 응답의 정량화는 개인 및 / 또는 실험 조작에 대한 응답의 그룹 사이에 일반적으로 선천성 면역의 건강과 기능의 비교를 할 수 있도록 한 방법입니다. 여기서 우리는, 유도의 양, 개인 제브라 피쉬 배아의 그룹 간의 호흡 버스트 반응?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red	Life Technologies	11039-021
Deep Petri Dishes	VWR	89107-632
Plastic Transfer Pipettes	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes	VWR	21008-918
5 ml Serological Pipettes	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	BioTek	Contact BioTek
Black 96 Well Microplate	VWR	82050-728
25 ml Sterile Reservoirs	VistaLab	3054-2003
P200 Pipettor	Gilson	F123601
Multichannel Pipettor	VWR	89079-948
Pipette Tips	VWR	89079-478