감염 프로토콜<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt;와<em&gt; 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)</em

요약

C. elegans의 호스트 병원체 상호 작용을 연구 할 수있는 새로운 유전자 모델로 떠오르고있다. 여기에서 우리는 C. 감염 프로토콜을 설명 살모넬라 감염에 대한 방어의 숙주 유전자의 역할을 조사하는 이중 가닥의 RNAi 간섭 기법과 결합 된 살모넬라 티피 뮤 리움과의 elegans.

초록

지난 10 년, C. 엘레은 그람 음성 박테리아 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)에 대한 숙주 방어를 포함하여, 호스트와 병원체 사이의 상호 작용을 연구하는 무척추 생물로 떠오르고있다. 살모넬라 균은 C.의 소장에서 지속적인 감염을 설정 엘레 감염된 동물의 조기 사망의 결과. 면역기구의 수는 C.에서 확인되었다 살모넬라 균 감염에 대해 방어하는 엘레. autophagy에, 진화 적으로 보존 된 리소좀의 분해 경로는 C에서 살모넬라 균의 복제를 제한하기 위해 표시되었습니다 엘레와 포유류. 여기서, 프로토콜은 C. 감염 설명 벌레가 인간의 살모넬라 균 감염과 유사한 제한된 시간에 대한 살모넬라 균에 노출 된 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)와 엘레. 살모넬라 균 감염은 크게 C.의 수명을 단축 엘레 </ EM>. 예를 들어 필수 autophagy에 유전자 BEC-1을 사용하여, 우리는 C.으로이 감염 방법을 결합 엘레 RNAi의 접근법은 먹이와이 프로토콜은 C.의 기능을 검사하는 데 사용될 수 보였다 살모넬라 균 감염에 대한 방어 엘레 호스트 유전자. 이후 C. elegans의 전체 게놈 RNAi의 라이브러리를 사용할 수 있으며,이 프로토콜은 포괄적 C.에 대한 화면으로 가능하게한다 게놈 전체의 RNAi 라이브러리를 사용하여 살모넬라 균 등 장내 병원균에 대한 보호 elegans의 유전자.

서문

독립 생활 토양 선충 Caenorhabditis의 엘레 많은 생물학적 질문을 연구하는 데 사용하는 간단하고 유 전적으로 다루기 쉬운 모델 생물이다. C. 엘레 지배적 자기 시비 자웅 동체로 존재합니다. 남성은 자발적으로 배우자 형성 ^1,2 동안 X 염색체의 비 분리에 의해 생성됩니다. 풍부한 음식, C.의 존재 엘레 지속적으로 성인 네 애벌레 단계를 통해 개발. 온도는 C.에 영향을 elegans의 개발; 빠른 개발은 높은 온도에서 관찰된다. 실험실에서, C. 엘레 음식 ^1,2 시드 박테리아 대장균 (주 OP50)와 한천 플레이트에서 20 ° C의 표준 온도에서 배양.

지난 10 년, C. 엘레 호스트 병원체 상호 작용 ^3-5을 연구하는 무척추 생물로 떠오르고있다. 자연에서, C. 엘레는 nutrien으로 박테리아를 먹는다T ^{소스, 2.} 정상 세균 실험실 음식, OP50은 쉽게 C. 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 다른 병원체로 치환 될 수있다 엘레 및 선택 병원체. 이러한 조건에서, 대장은 감염의 기본 사이트이다. 실제로, 세균성 병원체의 넓은 범위는 치명적 C. 감염을 보였다 엘레 ^3-5.

그람 음성 박테리아 살모넬라 균은 전 세계적으로 ^6,7 인간 식중독을 일으키는 위장 병원체이다. C. 이 박테리아가 복제 및 지속적인 장내 감염 ^{8-10 전시로} 엘레는 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)에 대한 좋은 모델 호스트입니다. C. 엘레 참신한 모두를 식별하는 데 사용되었으며, 이전에 공지 된 살모넬라 병원성 ^{11 요인.} 흥미롭게도, C. elegans의 면역 체계가 성공적으로 살모넬라 균의 복제를 제한합니다. 그것은 그 저해에게 이전에보고 된autophagy에 유전자의 ition는 C. 증가 살모넬라 복제를 렌더링 엘레 감염된 웜 ^(10)의 조기 사망의 결과. (여기에 autophagy라고 함) Macroautophagy이 저하 ¹² 리소좀에 배달 세포질과 세포 기관을 격리시키는하기 위해 세포 내 세포막의 재 배열을 포함하는 역동적 인 과정이다. 에 autophagy는 C.에서 살모넬라 복제를 제한하기 위해보고되었다 엘레와 포유류 ^{10, 13에.}

C. elegans의 게놈 염기 서열 첫 번째 다세포 진핵 생물의 게놈이었다; 이는 RNAi의 치료 ^14-16에 응답한다. 또한,이 RNAi의 RNAi의이 ^{(16, 17)를} 먹이로 알려진 표적 유전자의 이중 가닥 RNA를 포함하는 박테리아를 섭취하도록 웜을 실시함으로써 효과적으로 투여 될 수있다. 전체 게놈 RNAi의 먹이 라이브러리는 게놈 전체의 RNAi는 ^{16, 18 심사에} 대해 생성되었습니다. 여기서, 살모넬라 균 감염 프로프로토 콜은 RNAi의이 테스트 C. 허용하도록 먹이와 결합 살모넬라 균 감염으로부터 보호하기 위해 자신의 능력에 대한 관심 elegans의 유전자.

프로토콜

1. XLD (크 실리 톨 리신 데스 옥시 콜레이트) 한천 플레이트

XLD 한천 XLD 한천 플레이트에 검은 식민지로 나타납니다 살모넬라 균에 대한 선택 성장 매체입니다. 오염 될 우려가없는 경우에는, 정규 LB 플레이트가 치환 될 수있다.

1. 5 ㎖의 탈 이온수에 5.5 g의 XLD 한천과에 resuspend를 달다.
2. 모든 한천 젖은 때까지 철저하게 섞는다. 모든 덩어리가 사라과 매체가 완전히 재현 탁 될 때까지 탈 이온수 95 ML을 추가합니다.
3. 완전히 (압력솥하지 않음) 용해 매체를 끓인다.
4. 50 ℃의 실온에서 매체를 냉각
5. 각 95 x 15mm (직경 x 높이) 플레이트 (파라 필름으로 밀봉 플레이트가 1 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다)에 25 ㎖의 한천을 부어.

2. 선충류 성장 중간 (NGM)의 RNAi는 플레이트를 먹이는

C. 준비 엘레 NGM 플레이트는 이전에 설명 된 ¹9. 다음 절차는 짧게 RNAi의 먹이 접시를 만들기 위해 NGM 미디어에 항생제 암피실린 및 RNAi의 화학 유도 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 추가 할 설명되어 있습니다.

1. 3g의 NaCl 1 L 탈 이온수 2.5 g 박토 펩톤을 녹입니다.
2. 미디어에 17g의 박토 한천을 추가합니다.
3. 45 분 동안 미디어를 압력솥 수욕에서 50 ° C로 미디어를 냉각.
4. 1 ㎖ 콜레스테롤 (95 % 에탄올에 5 ㎎ / ㎖) 1 ㎖ 1 M _{염화칼슘,} 1 ㎖ 1 M _망초, 25 ㎖의 1 M 인산 칼륨 완충액 (pH 6.0) : 다음과 같은 솔루션을 추가합니다. 잘 섞는다.
5. 1 ㎖ 1 M IPTG 500 ㎕의 암피실린 (멸균 100 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
6. 잘 솔루션을 섞어 피펫 보조를 사용하여 멸균 절차에 따라 25 ㎖의 혈청 피펫 (60) X 15mm (직경 x 높이) 페트리 접시에 붓는다. 12 ML 한천 각 접시를 채우십시오. 플레이트는 최대 1 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

3 "jove_title". 감염에 대한 RNAi의 처리 동물을 준비

autophagy에 필수적인 유전자는 BEC-1은 살모넬라 감염에 대한 방어의 숙주 유전자의 기능을 검사하는 예로서 사용된다. 실험 절차는도 1 및 표 1에 도시된다. 감염의 RNAi-처리 된 동물의 제조 프로토콜은 괄호 안에 각 실험 단계의 일로, 다음과 같다.

1. BEC-1 RNAi의 먹이를 접종 및 100 ㎎ / ㎖ 암피실린 (1 일) 보충 2 ㎖ LB 배지에 -80 ° C 냉동 박테리아의 조각을 배치하여 빈 벡터 L4440 RNAi의 박테리아 먹이를 제어 할 수 있습니다. 신선한 RNAi의 세균을 가지고 전체 실험 기간 동안 일주일에 한 번이 단계를 반복합니다. 사용하지 않을 경우 4 ° C의 냉장고에 문화를 저장합니다.
2. RNAi의 접시에 하룻밤 RNAi의 세균 배양을 100 ㎖의 종자. 세 BEC-1 RNAi의 세 제어 빈 V를 준비RNAi의 판을 엑터. 37 ° C에서의 하룻밤 (2 일)에서 번호판을 품어.
3. 37 ° C의 배양기에서 RNAi의 플레이트를 제거하고 벤치에서 실온까지 냉각 할 수 있습니다. 잘 공급 L4 야생형 N2 자웅 동체를 들고 그들을의 RNAi-1 벡 빈 벡터 RNAi의 판을 제어하는 전송. 세중의 플레이트에 플레이트에 세 벌레를 놓습니다. 단계 3.2 (3 일)에 설명 된대로 같은 날, RNAi의 판을 준비합니다.
4. 3.3 단계에서 제조 된 신선한 해당 RNAi의 플레이트에 36-40 시간 및 전송 웜에 대한 20 ° C 배양기에서 벌레와 RNAi의 번호판을 품어. 웜이 전송 된 후, 64 시간 (4 일)에 20 °의 C 배양기에서 접시를 품어.

4. 감염 살모넬라 준비

1. 줄무늬 살모넬라 -80 ° C 냉동 1 XLD 한천 접시에 하룻밤 (5 일 37 ° C에서 접시를 품어 ).
2. 잘 고립 된 검은 살모넬라 식민지를 선택하고 (6 일) 밤새 진탕 37 ° C에서 2 ㎖ LB 배지에 접종.
3. 1 C.에 씨 80 ㎖의 살모넬라 균 배양 물 엘레 60 X 15mm (직경 x 높이) NGM 한천 플레이트와 총 6 판을 준비합니다. 6 시간 동안 실온에서 번호판을 품어. 세균 배양 접시 (주 7)에 잔디를 건조 형성한다.

살모넬라 5.을 감염 RNAi의 처리 벌레

1. 이동 BEC-1 RNAi의 처리 및 살모넬라 판에 빈 벡터 RNAi의 처리 L4 N2의 자웅 동체 (3 단계에서 설정 벌레의 자손)을 제어 할 수 있습니다. 각 그룹에 대해 3 접시에 접시 당 40 벌레를 놓습니다. 48 시간 (주 7) 20 ° C에서 웜 번호판을 품어.
2. 단계 3.1 및 3.2 (일 7에 설명 된대로 신선한 RNAi의 접시의 한 세트를 준비하고 8 일).
3. 48 시간 감염 후, 단계 5.2에서 제조 된 해당 RNAi의 접시에 살모넬라 균에 감염된 웜을 전송하고 20 ° C (9 일)에 품어.

6. 생존 분석

1. 매일 벌레의 생존을 점수와 알을 낳는 시간 동안 신선한 해당 RNAi의 플레이트로 웜을 전송합니다. 단계 3.1 및 3.2에 설명 된대로 이전에 각 웜 전송에 신선한 RNAi의 접시 세트를 준비합니다. 부드럽게 끝 평평 백금 와이어 웜 몸 (머리, 중간 부분 및 꼬리)를 터치합니다. 웜 본체의 어떠한 움직임이 관찰되지 않은 경우 웜 죽은로서 획득된다.
2. 매일 웜 또는 매일의 생존을 점수와 벌레가 산란을 중단 한 후 일주일에 두 번 신선한 해당 RNAi의 플레이트로 웜을 전송합니다.
3. 모든 벌레가 죽은 후에, 하나의 데이터 세트로 세중 판에서 생존 데이터를 풀. 같은 그래프 패드 P 적절한 통계 소프트웨어에 각 그룹의 입력 생존 데이터생존 곡선을 생성하고 Kaplan-Meier 생존 분석을 수행 할 rism. 전체 실험의 결론을 확인하기 위해 한 번 이상 반복한다.

결과

20 ° C에서, 야생 형 N2 벌레의 평균 수명은. 살모넬라 균 감염이 크게 10.5 일 N2 웜의 평균 수명을 감소 십칠일 (그림 2A 및 표 2)는 (P = 0.0002, 로그 순위 검정) (그림 2A ).

만약 C. 엘레 유전자는 살모넬라 감염에 대한 방어에 중요한 역할을, 그것은 그것의 억제는 살모넬라 감염에 대한 감수성을 부여 할 것으로 예상된다. ?...

토론

C. elegans의는 영양원으로 세균을 먹는 간단한 유전자 모델 생물이다. 따라서, C. 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 장내 병원체 정상 세균 음식을 대체하기 쉽다 엘레 및 선택 병원체. 여기 프로토콜은 살모넬라 균 감염과 C를 결합하여 설명 엘레 RNAi의 살모넬라 균 감염에 대한 방어의 호스트 유전자의 역할을 조사하는 치료를 먹이. 이전 감염 프로토콜은 <...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth	Fisher	BP9723-500
XLD agar	EMD Chemicals	1.05287.0500
Bacto Agar	Fisher	DF0140-01-0
Peptone	Fisher	BP1420-500
Sodium Chloride	Fisher	S671-500
Calcium Chloride	Fisher	C69-500
Magnesium Sulfate	Fisher	M65-500
IPTG	Gold Biotechnology	12481C50
Cholesterol	Sigma	C8667-25G
Ampicillin	Fisher	BP1760-25
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm	Fisher	FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm	Fisher	08-757-13A
Falcon Serological pipet	Fisher	13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid	Fisher	13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE6000-7
Incubator	Percival	I-36DL