마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

요약

고환 마우스 세포에 대한 형질 전환 기술은 정자의 고유 한 프로세스를 공부로이 문서에서는 생체 내에서 미세 주입 및 마우스 고환의 일렉트로에 대해 설명합니다. 제시된 프로토콜은 전기 천공 법 (electroporation)에 의해 유리 모세관 준비, 원심성 덕트를 통해 미세 주입하고, 형질 전환의 단계를 포함한다.

초록

이 비디오 및 문서 기여 미세 주입 및 생체 내에서 마우스 고환의 일렉트로의 포괄적 인 설명을 제공합니다. 고환 마우스 셀이 특정 형질 전환 기술은 정자의 고유 한 프로세스의 연구를 할 수 있습니다.

다음 프로토콜 플라스미드 구성체와 마우스 정소 세포의 형질 전환에 초점을 맞추고있다. 특히, 우리는 적색 형광 단백질 (DsRed2)을 표현하는 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 또한 pDsRed2-N1 벡터를 강화 표현하는 기자 벡터 pEGFP-C1을 사용했다. 두 부호화 리포터 유전자는 인간 사이토 메갈로 바이러스의 즉시 초기 프로모터 (CMV)의 제어하에 있었다.

마우스 정소에 유전자 전달을 수행하기 위해, 리포터 플라스미드 구성체는 살아있는 마우스의 고환에 주입된다. 이를 위해, 마취 동물의 정소는 노출 및 마이크로 인젝션의 사이트가 제조된다. 우리의 선호하는 장소주입은 고환과 부고환의 정자의 해부학 전송 경로와 궁극적으로 연결 RETE의 고환과, 원심성 덕트입니다. 이러한 방식으로, 마이크로 인젝션 후 정 세관의 충전은 양호 인해 DNA 염색 용액의 사용을 관리하고 제어한다. 그 컬러 세관 구조 정소의 충분한 충전을 관찰 한 결과, 기관은 전기 천공이다. 이는 고환 세포 내로 DNA 용액의 전송을 가능하게한다. 배양 3 일 후, 정소 제거하고, 형질 전환의 성공을 나타내는, 녹색 또는 적색의 형광 현미경으로 조사 하였다.

일반적으로,이 프로토콜은 DNA- 또는-RNA를 전달하기 위해 이용 될 수는하기 위해 살아있는 마우스 정소로 구성한다 (위에) 표현 또는 생체 내 유전자 기능 분석에 용이하게 유전자를 노크. 또한, 리포터 구조 또는 추정되는 유전자 REGULA 공부 적합토리 요소입니다. 따라서, 전기 천공 기술의 주요 장점은 다른 기술에 비해 낮은 필요한 노력뿐만 아니라 적당한 기술 장비 및 기술과 함께 빠른 성능이다.

서문

포유 동물은 성숙한 정자 반수체 정자로 개발하기 위해서는 순차 유사 분열, 감수 분열 및 분화를 겪고 자기 갱신 줄기 세포의 복잡한 과정으로 간주된다. 이러한 형태 학적 변화는 다양한 세포 유형에 의해 조율되는 중후 시도에도 불구하고, 세포 배양 ^1,2에서 이러한 프로세스를 모방 여전히 불가능하다. 따라서, 지금까지의 정자에 대한 연구는 생체 내 모델로 살아있는 유기체에 의존한다. 일반적으로, 유전자 기능 연구는 일반적으로 형질 전환 동물에 기초한다. 그러나, 생성하여 동물 모델이 종류를 유지하는 것은 시간 소모적이고 비용 집약적 꽤 정교하다. 이것은 생성하고 세대 위에 유전자를 유지하기위한 필수 사육 긴 프로세스에 기인한다. 또한, 형질 전환 또는 녹아웃 방법에 의해 전체 유기체의 유전자 조작은 g을 타겟팅 생리적 장애를 유발하는 경향이있다예를 들어 여러 지역에서 필수적인 기능, 고환 외부 또는 체계적으로 ENES.

또한, 일부 과도 형질 전환 방법은 몇 가지 중요한 단점과 연관되어 있습니다. 리포 펙 ³ 및 마이크로 입자 충돌 ⁽⁴⁾ 조직을 손상시킬 수있는 충분한 형질 전환 효율을위한 특정 세포 깊이로 제한되어있는 반면 예를 들어, 바이러스 매개 유전자 전달의 일반적인 단점은, 면역 반응 및 추가 안전 규정의 가능한 도발이다.

대조적으로, 일시 발현의 또 다른 일반적인 방법으로 전기 천공 (EP)은 생체 내 형질 감염과 일관된 생체 유전자 분석에서 활성화하는 유망한 기술을 구성하는 것으로 보인다. 일반적으로, EP는 나노초 이내 결과적 매개 기공 로컬 막 관통 전압에 따라 동적 현상이라한다. 이러한 갭은 밀리 초 동안 유지 될 수 있고, 충분한 tO DNA, RNA 또는 작은 분자 ^(5)에 대한 액세스 권한을 부여. 인가 전압이 너무 높으면, 일반적으로 EP의 과도 특성은 열에 의한 생산과 셀 ^(5)의 결과적으로 돌이킬 수없는 손상이 너무 광범위한 permeabilization 유도로 상쇄된다.

여기서는 일렉트로가 생체 내에서 고환 유전자 특성을 규명하기 위하여 유전 정소 변환을 위해 이용 될 수있는 효과적이고 경제적 인 형질 전환 시스템임을 보여준다. 이 문서에서는 원심성 덕트 및 마우스 고환의 후속 일렉트로을 통해 플라스미드 준비, 미세 주입을 해결합니다. 이 절차는 정자 생성의 과정을 조사하기 위해 생체 내 마우스 고환의 정 세관의 신속하고 효율적인 특정 형질 감염을 달성하기 위해 선택하는 수단이 될 수있다.

프로토콜

모든 수행 동물 실험은 로컬 윤리위원회 (Landesamt 엘리제 Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit 싶게 Fischerei, 메 클렌 부르크 - 포어 포메 른, 독일)에 의해 승인되었습니다.

1 플라스미드 준비

1. 플라스미드 제제를 들어, 플라스미드 정제 키트 (재료 표 참조) 또는 동물의 면역 반응을 피할 수 있도록 독소 제거 버퍼와 유사한 방법을 사용한다. 설명서의 지시 사항을 따르십시오. 플라스미드 용액을 희석 DDH O _2를 사용한다.
2. 최대 속도 (20,000 XG)에서 DNA 용액을 회전시켜 이물질을 제거합니다. 그런 다음 상층 액을 수집합니다.
3. 분광 광도계 (자료 참조) 플라스미드 농도를 결정합니다.
4. 1-3 μg (DNA) / μL로 DDH ₂ O 플라스미드 농도를 조정합니다. 참고 : 높은 농도가 너무 점성 주사액이 발생할 수 있습니다 동안 낮은 농도는 형질 전환 효율을 감소시킬 것이다. 게다가형질 전환 효율은 플라스미드의 크기에 따라 개별적으로 시험되어야한다.
5. 주사 이전에, 함께 혼합 용액을 제조 5 ㎕의 PBS (10 배) 및 5 μL 패스트 그린 (0.5 %)과 함께 예 40 μL 플라스미드 대. 패스트 그린 사출 공정의 추적이 필요하다. 바람직하게는, 얇은 벽 PCR 튜브 또는 파라 필름을 사용합니다. 주 : 정소의 크기 따라 20-50 μL의 부피는 각각의 정소에 필요한 것이다.

미세 주입 피펫의 2 준비

1. 미세 주입 피펫을 제조 붕 규산염 모세관 (재료 표 참조)를 사용합니다.
2. 수직 모세관 풀러 유리 모세관을 당겨 (재료 표 참조).
3. 부드럽게 밴딩에 의해 집게로 모세관 팁을 휴식. 팁은 보통 50 ~ 80 μm의 직경이 약 1cm 길이입니다. 이러한 조직을 관통 할만큼 딱딱하지 너무 오래 팁을 피하기 위해보십시오.
4. 마지막으로, 샤에서마이크로 피펫의 beveler을 (재료 표 참조)를 사용하여 45 ° 각도 30 °에서 팁을 rpen.
5. 주사액 믹스와 미세 주입 피펫을로드 (플라스미드 준비 참조). 작은 주사기와 유리 모세관의 뒷면에 솔루션을 적용합니다. 참고 : 전도성을 줄일뿐만 아니라 가능성이 조직 손상의 원인이됩니다 따라서, 그렇지 않으면 이러한 플라스미드 용액과 함께 정 세관에 주입되며,로드하는 동안 공기 방울을 피하기 위해보십시오.

3 마취 및 수술

1. 멸균 (즉, 주사기, 바늘, 수술기구 등) 소재를 이용하여 무균 조건 하에서 작업을 수행한다. 이는 동물의 감염을 감소시키고 좋은 생존율을 보장 할 것이다.
2. 6~8주의 나이에 전기 천공 법 (electroporation)에 대한 수컷 마우스를 사용합니다.
3. 수술후 진통제 처리를 초기화하기 위해, 진통제와 마우스가 수술 전에 날 식수 추가 제공한다. 이 엉덩이가능성이 매우 높은 수술 후 hypodipsia (감소 물 섭취량) 가지 경우에 선제 진통제를 유레스. 이를 위해, 예를 들면 소아 이부프로펜 현탁액 (20 ㎎ / ㎖)로 식수 노출. 약용 마시는 물은 일 하나와 동일한 농도의 두 가지 복구에 공급한다. 이 C57BL / 6J 세 팔주에 대한 25g의 5 ㎖ / D 마시는 물과 체중에 대한 유효한 7.5 밀리그램 / kg의 투여 량을 의미한다. 이 진통제 처방은 근본적인 통증 완화와 높은 복지 ^(26)와 함께 가속 복구를 보장합니다.
4. (재료 표 참조) : 1의 비율로 수술 당일 작업 액 마취의​​ 제조, 1 Ketamin 10 % 및 2 %의 자일 라진을 섞는다.
5. 마취 솔루션 피하의 0.25 ㎖ / 100 mg을 체중 적용, 동물을 마취 (Ketamin = 0.125 g / kg을, 자일 라진 = 0.025 g / kg)를. 생쥐의 기관 손상 및 손상을 방지하기 위하여 골반과 다리 사이의 주사 부위를 사용한다. 일반적으로, 10 분을 필요때까지 마우스는 깊이 마취됩니다.
6. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 수의사 연고 마우스 눈을 감아 라.
7. 응답의 총 부족에 의한 눈에 띄는 깊은 마취 체포를 테스트합니다. 이를 위해, 단지 동물의 발가락을 꼬집어.
8. 수술을 시작하려면 전기 면도기 또는 유사한 복부와 머리를 제거하고 sterilium 또는 유사한로 작업 영역을 소독.
9. 직접 복부의 중앙에 preputial 분비 이상으로 복부 절개를합니다. 그 곳에서, 첫번째 떨어져 피부를 당겨 약 8-14mm의 작은 횡단 피부 상처를 실시하고 있습니다. 그런 다음, 복부 근육 층을 따라 계속합니다.
   주 : 동물에게 피해를 감소시키기 위해 가능한 한 병변이 작아야한다.
10. 첨부 된 고환을 노출 단지 절개 사이트 (그림 2A) 옆에 사전 준비 방수 일회용 종이 드레이프에 배치 조심스럽게 복부 지방 패드를 당깁니다.
11. F에 쌍안경을 사용하여주입 대상의 원심성 덕트 산업사. 동맥관 원심성은 고환과 부고환의 미세 혈관 접합으로 식별됩니다. 그것은 눈에 띄는 고환 동맥에 인접 해 있습니다. 동맥관은 동맥에 45 °의 각도로 거의 실행하고 눈에 띄게 CAPUT의 epididymidis 들어갑니다. 참고 : 마우스의 연령에 따라, 동맥관은 일반적으로 지방 조직에 묻혀있다.
12. 이 지방 조직의 원심성 덕트를 취소 미세 집게를 사용합니다. 그 후, 주변 환경을 손상시키지 않고 덕트의 명확한 가시성을 보장하기 위해 무균 종이 스트립에 출시 된 동맥관을 배치합니다.

(4) 미세 주입 및 DNA 응용 프로그램

1. 미세 조작기 / 인젝터 장치에 플라스미드 솔루션과 함께로드되는 미세 주입 피펫을 연결합니다.
2. 끝이 RETE의 정소 (그림 2B)를 가리키는 원심성 덕트에 미세 주입 바늘 평행하게 배치합니다.
3. 미세 핀셋을 사용하여미세 주입 피펫을 통해 덕트를 제거. 이를 통해 당기면서 모세관 덕트에 평행하게 유지되어 있는지 확인합니다.
   참고 :이 절차는 미세 조작기로 바늘을 이동하여 배를 관통보다 편리합니다.
4. 고환을 향해 조심스럽게 바늘을 지시하고의 Tunica albuginea (그림 2C) 바로 아래에 RETE의 고환을 관통로 그만.
   주 : RETE의 정소를 과한의 경우, 플라스미드 용액 격자 간 공간으로 누출된다. 이것은 일반적으로 정 세관을 형질의 실패로 이어집니다.
5. PI : 100 고전력 증폭기, TI : 0.2 초 및 pc : 0 고전력 증폭기 (그림 2D) 플라스미드 용액의 주입을 위해 다음과 같은 설정으로 microinjector를 사용합니다.
6. 녹색의 도움으로 충전 상태를 관찰하여 정소 전체 주입 프로세스를 모니터링. 고환에만 PL과의 볼륨의 2/3까지 가득주의해야asmid 솔루션 (그림 2E).
   주 : 분사량을 초과하면, 정소 조직을 다치게 할 수있다.

고환의 5 일렉트로

1. 효과적인 일렉트로 수 있도록 PBS (1 배)에 트위터 전극을 담가합니다. 이것은 충분한 전도성을 보장합니다.
2. 부드럽게 젖은 전극 (그림 2 층) 사이의 고환을 짠다. electroporator와 전기 저항을 측정합니다.
3. 고환에 현재 적용합니다. 50 밀리 초 펄스 시간 950 밀리 초 간격 시간의 일정 기간에 4 개의 고환 사이트에서 40 V의 팔 사각형 펄스를 수행합니다.

(6) 상처 봉합하고 수술 후

1. 전기 천공이 완료되면 다시 원래 위치에 배치 정소.
2. 수술 봉합 (자료 참조) 내부 근육 층을 바느질.
3. 봉합 클립 (재료 표 참조) 이용하여 피부를 닫습니다. 피부까지 재치를 당겨시간 핀셋. 근육 층을 제외해야합니다. 하게는 5 mm 이하의 거리에서 클립, 각 놓습니다.
   주 : 외과 용 봉합이 마우스 삼킬 수 있으므로, 봉합 클립 피부 병변을 폐쇄 선호된다.
4. 마우스가 37 ° C 따뜻한 패드에 강화 된 무균 빈 마우스 케이지에 넣고 멸균 종이 타월에 마취에서 회복 할 수 있습니다. 패드는 열 구배를 생성 케이지의 절반의 온난화를 확인해야합니다. 동물의 경우이 때문에 케이지의 온도 다양한 개인, 가장 편안한 지역을 검색 할 수 있습니다. 또한, 응력이 더욱 감소 될 수 있도록 멸균 종이 타월 시트와 마우스를 포함한다. 주 : 마우스의 신체 표면은 체질량과 관련된 대단히 높기 때문에 더 큰 동물과 비교했을 때, 열 지원 설치류의 성공적인 복구에 특히 중요하다.
5. 운영하는 동물이 완전히 깨어 때, 난을 전송완전히 장착 된 새로운 마우스 케이지을 추가로 복구 t. 옛 케이지 또는 쥐의 그룹에 다시 동물을 넣지 마십시오. 케이지는 상처의 감염을 방지하기 위해 가능한 한 깨끗하고 무균 있는지 확인하십시오. 전체 복구 프로세스를 모니터링합니다. 완전히 회복하고 정상적으로 작동하도록 나타납니다 때까지 다시 동물 보호 시설에 마우스를 전송하려면 기다립니다.
   주 : 추가 당과 수술 후 전략 (Pritchett)의 코닝 KR 외 ^(6)에 의해 설명되어 있습니다.

결과

그것이 사용되는 바와 같이 생체 내에서 마우스 정소의 미세 주입 및 전기 천공을 수행하는 프로토콜에 따라 대한 실험 환경은 그 공업 적 제조 마이크로 피펫을 획득 할 수있다하더라도.도 1에 도시되어, 우리는 (도 1a 당기는 자체 피펫을 생성하는 것이 바람직 있도록) 및 베벨 (그림 1B) 유리 모세관 그들은 우리의 요구를 장착. 마이크로 인젝션 용 및 ...

토론

특히 남성 불임 필연적으로 정자의 지역에서 생식 생물학 분야의 연구는 살아있는 유기체에 의존합니다. 고환의 기능을 검사하기 위해, 어떠한 적절한 세포 배양 / 시험 관내 시스템은 반수체 성숙한 정자에 ^1,2 이배체 spermatogonium 모든 중요한 형태 학적 변화를 반영 할 수있는 확립되지 않았다. 따라서, 유전자 변형 동물의 발생이 종종 필요하고 남성 생식 생물학 등으?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Sigma	1-15 PK
Spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
Microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
Micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
Electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
Tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
Microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	homemade		XYZ cross table
Surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
Fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
Surgical suture	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
Syringe with 30 G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10% Ketamine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofen, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1