높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

요약

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

초록

우리는 새로운 신호 전달 경로를 밝히기 위해 사용될 수 인산화 기판 전용 인간 단백질 키나제를 식별하기위한 스크리닝 플랫폼을 개발했다. 우리의 접근 방식은 정제 GST - 태그 인간의 단백질 키나아제의 라이브러리와 관심의 재조합 단백질 기판의 사용을 특징으로한다. 우리는, CREB-규제 전사 보조 활성화 인자 2 (CRTC2)에 글루코스 조절 사이트 키나아제 MAP / 미세 소관 연관 조절 키나제 2 (MARK2)를 식별하는 베타 세포의 증식에 필요한 단백질뿐만 아니라을이 기술을 사용한 티로신의 액슬 제품군은 어댑터 단백질 엘모의 인산화에 의한 세포 전이의 규제로 키나아제. 우리는이 기술을 설명하고 세포가 환경 자극에 반응하는 방법의 포괄적 인지도를 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다 방법에 대해 설명합니다.

서문

단백질 번역 후 변형 (PTMS)는 세포 내 통신을위한 필수적이다. 아마도 모든 PTMS의 연구 최고 세포 내 현지화, 형태, 안정성, 생화학 적 활동을 포함한 단백질 기능의 무수를 조절 단백질 인산화 효소에 의해 촉매 인산화이다. 표적 단백질의 인산화 부위의 식별은 트립신 포스 포 매핑 또는 인산화 펩티드 ^1,2- 위해 농축 된 샘플을 이용하여 현재 표준 프로테옴 기법에 의해 달성 될 수있다. 발현 프로테옴 사분의 삼가 ³ 인산화 될 것으로 예상하고 100 만 ^6까지 예상치 200,000 인산화 부위 ^5를 식별하는 동안, 이들의 대부분은 통로 또는 단백질 키나제 시그널링 어떠한 할당 생물학 없다.

인산화 사이트의 식별은 비교적 큰 도전이고, 비교적 간단하지만기판 쌍 :이 사이트를 대상으로 동족 키나제 (들), 우리가 매핑 키나제로 참조하는 프로세스를 식별합니다. 기판 쌍이 설명되었지만, 어느 주목 키나아제로 시작하고 그 기판을 찾고 관심 또는 기판에서 시작하여 개질 키나아제 ^7-11 또는 실험적 계산 ^(12)을 찾기 위해 시도 : 키나아제를 식별하기위한 여러 가지 방법. 공지 인산화 기판 키나제를 식별하는, 생물 정보학 기판과 강수량 복합체를 형성 키나제 인산화 잔사 (컨센서스 사이트) 측면뿐만 아니라 식별 아미노산의 짧은 보존 된 서열을 포함하는 단백질을 식별하는 데 사용될 수있다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되어 종종 성공을 충족하지 않습니다.

우리는 주어진 빠르게 기판 ^(13)을 인산화 키나아제를 식별 체계적인 접근 기능을 개발 하였다. 스크린 분석법 우수한 특정을 생산잠재적 인 동족 키나제에 대한 아주 명확한 선택과 성만. 생물학적 신호에 인산화의 중심성을 감안할 때, 스크린은 거의 모든 세포 신호 전달 경로 ^14-16에서 발견에 유용합니다. 스크린은 인간 단백질 키나제의 라이브러리로 대규모 키나아제 분석을 수행하는 것을 포함한다. 키나아제는 박테리아 글루타치온 S 트랜스퍼 라제 (GST) 단백질로 태그 된 재조합 효소 즉, 포유 동물 세포 추출물로부터 정제 - 박테리아로부터 제조 된 것과 달리 - 종종 필요한 상류 단백질 키나제의 존재하에 생성되고 재조합 효소는 시험 관내에서 활성을 갖는. 세린, 트레오닌 및 티로신 키나제 활성이 하류 키나제 활성화에 필요하면서 실제로 효모 ^(10)에 존재하는, 효모 게놈은 500 유전자 ¹⁷ 포유류 kinome는,하기 위해 훨씬 더 복잡해질 것을 나타내는, 122 단백질 키나제를 코딩 REGULA고차 생물에 고유의 프로세스를 테. 또한, 세포 생물학 및 (등과 소분자, 성장 인자, 호르몬 등) 인간의 질병과 관련된 다른 자극의 효과는 적절한 컨텍스트 ^{(14, 15)는} 조절 키나제 활성에 사용될 수있다.

프로토콜

시약, 플레이트, 및 세포의 1. 준비

1. 25 mM 트리스 pH가 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 50 mM의 불화 나트륨, 0.5 mM의 EDTA pH를 8.0, 0.5 % 트리톤-100, 5mM의 베타 - 글리세로 포스페이트, 5 % 글리세롤 : 500 ml의 용해 완충액을 만든다. 4 ℃에서 보관하십시오. 사용 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT), 1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 및 1 mM의 나트륨 바나 데이트를 추가하기 직전. 이 단계 후에, PMSF가 임의의 세정 완충액으로 요구되지 않는다.
2. 200 mM 트리스의 pH 7.5, 50 mM의 베타 글리세 (FW 216), 2 mM의 나트륨 바나 데이트 : 10 배 키나제 버퍼의 20 mL로한다. -20 ° C에서 1 ml의 튜브에 나누어지는 및 저장. 사용 5 mM의 DTT를 추가하기 직전.
3. 300 μM 아데노신 삼인산 (ATP), 66 밀리미터의 MgCl _2, -20 ° C에서 33 mM의 MnCl ₂ 1 ml의 튜브에 나누어 저장 : 10 배 M-ATP 버퍼의 20 mL로한다.
4. 배 도데 실 황산나트륨 100 mL로 (SDS)를 용해 완충액 : 1.5 g 트리스베이스, 글리세롤 20 ㎖, 30 ㎖의 H ₂ O. 용해 및 HCl로 6.8에 산도를 조정합니다. 40 추가ml의 10 % SDS는 100 ㎖에 볼륨을 조정합니다. 25 mg의 브로 모 페놀 블루를 추가합니다.
5. 스팟 따라 96 웰 플레이트와 라벨 플레이트 세트에서 잘 당 GST-키나제 ^(14)를 인코딩 (25) NG / μL 포유 동물 발현 플라스미드의 4 μL. 사용할 때까지 -20 ° C에서 인감 및 동결 판.
6. 형질 전환 1-2 일 전에, CO ₂ (최종 5 %)로 보충 된 37 ℃ 배양기에서 배양 HEK293T의 완전한 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) + 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 항생 물질의 세포. 트립신과 통로는 주식이 확장시> 80 % 합류가 될 수 없습니다. 6 × 10 ⁷ 세포의 최소 화면 (80 % 합류에 HEK293T 세포의 약 3 × 15cm 요리)가 필요합니다.

2. 형질

참고 : 전체 프로토콜의 흐름도는 그림 1을 참조하십시오.

1. 키나아제 플라스미드를 함유하는 플레이트를 동결 되었으면, 실온에서 해동차 우물의 바닥에서 습기를 수집하기 위해 3 분 동안 1,900 XG에 원심 분리기.
2. 지질 기반 형질 전환 시약의 312.7 μL와 감소 혈청 배지 (예를 들어, OPTI-MEM)의 8.6 ml의 혼합. 5 분 동안 앉아 보자.
3. 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 각 웰에 감소 혈청 매체의 10 μl를 추가합니다.
4. 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용 단계 2.2에서 감소 된 혈청 배지 / 형질 전환 시약 믹스 잘 당 10 μl를 추가합니다. 20-45 분 동안 앉아 보자.
5. 전체 80ml의 DMEM에 7.5 × ¹⁰⁵ 세포 / ml로 재현 탁 293T 세포. 잘 표준 볼륨 카세트 ​​장착 자동 액체 디스펜서를 사용하여 당 세포 현탁액 (즉, 7.5 × 10 ⁴ 세포)의 100 μl를 추가합니다.
6. 균일 한 세포 분포에 대한 현미경으로 우물을 확인하고 24 시간 동안 인큐베이터로 돌아갑니다.

3. GST-키나제 풀다운

1. F 확인resh : H ₂ O의 540 μL와 0.2 M 나트륨 바나 데이트 60 μl를 혼합하여 4 mM의 pervanadate 솔루션 제 2 튜브 믹스 30 % 과산화수소 2.7 μL와 PBS 1.4 ml 중에. 함께 두 가지 솔루션을 추가하고 사용하기 전에 15 분 동안 앉아 보자.
2. (이것은 또한 너무 많은 난류를 생성로서 자동화 액체 디스펜서를 사용하지 않는) 단계 3.1에서 제조 pervanadate 2.5 μL,이어서 각 웰에 0.25 M _CaCl2를 2 μL 분주 멀티 채널 피펫을 사용. 10 분 동안 37 ℃에서 각각의 판을 품어 후 얼음에 배치합니다.
3. 제 1 (시약의 제조)에 나타낸 바와 같이 DTT, PMSF, 나트륨 바나 데이트를 첨가하여 용해 완충액 35 mL로 제조.
4. 얼음에 판을 유지, 각 웰 진공 흡입기를 사용하는 매체를 제거합니다. 즉시 표준 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 50 μL / 웰의 차가운 얼음 용해 버퍼를 추가합니다. 를 Lyse에 얼음에 30 분 앉아 보자 (옵션 : 작은지면을 밀봉하여 여기에 필요한 경우 중지 할 수 있습니다전자 및 -80 ° C에서 저장. 얼음에, 해동 판)을 계속합니다.
5. 4 ℃에서 3 분 동안 1,900 XG에 스핀 판.
6. 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하는 세포를 긁고 모든 내용을 전송 적절 V 바닥 96 웰 플레이트를 표시합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,900 XG에 스핀 판.
7. 회전하는 동안, 린스 100 μL / 웰의 (PMSF)없이 차가운 얼음 용해 버퍼와 글루타티온 코팅 된 플레이트 (각 96 웰 플레이트에 대해 하나)를 입력합니다. 얼음에 판을 보관하십시오.
8. 원심 분리기에서 V-바닥 플레이트를 제거합니다. 한 번에 하나는 종이 타월에 용해 버퍼와 얼룩을 흔들 싱크를 통해 글루타티온 판을 반전. 하단에있는 펠렛을 방해하지에주의하면서 판을 기울 멀티 채널 피펫을 사용하여 글루타티온 판에 V-바닥 판에서 용해 버퍼를 전송합니다. 판 커버와 결합하는 최소 2 시간 동안 얼음에 둡니다.
9. 2 시간 바인딩 단계의 마지막에 가까운, T을 보장 방사능 워크 스테이션을 준비그는 필요한 안전 조치는 방사성 작업 장소에 있습니다. 30 ° C로 설정 하이브리드 오븐.
10. 이 단계에서 필요하지 않은 제 1 절 PMSF에 표시된 추가 DTT 나트륨 바나 데이트에 의해 용해 완충액 200 ㎖를 준비합니다.
11. 용해 버퍼를 흔들 종이 타월에 가릴 수있는 싱크대 글루타티온 플레이트 전환. 헹구고 웰 (PMSF)없이 100 ㎕의 용해 완충액으로 3 배. 진행 할 준비가 될 때까지 세정에 보관 - 우물이 마른 앉게하지 마십시오.
12. 10 배 주식을 희석하고 표준 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 1X KB의 50 μL 1. 린스 판 한 번 섹션에 표시된대로 DTT를 추가하여 1X 키나제 버퍼 (KB) 55 mL로 준비합니다. 솔루션이 준비가 될 때까지 우물에 1X KB를 남겨주세요 :
    1. 15.9 ml의 최대 530 관심있는 기판의 μg의, 미엘린 염기성 단백질 500 μg의 (MBP), 10 배의 2.65 ml의 KB, 1 M DTT의 13.25 μL, 및 H ₂ O 500을 추가하여 솔루션을 준비합니다.
13. 한 번에 하나씩, 1X KB 린스를 제거 종이 수건에 오점, 바로 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하는 솔루션의 30 μl를 추가 싱크대 위에 접시를 반전. 얼음에 판을 보관하십시오.
14. 2.5 ml의 10 배 M-ATP, 500 μCi를 감마 ⁽³²⁾ P의 ATP, 및 H ₂ O에 10 ㎖를 첨가하여 방사능 작업 영역 용액 B를 준비한다.
    1. 잘 배출 힘에 의한 혼합에 도움 리피터 피펫을 사용하여 당 용액 B 20 μl를 추가합니다. 덮고, 30 분 동안 30 ° C의 오븐에서 혼성화 부화.
15. 30 분 후, 얼음에 다시 접시를 전송합니다. 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하여 2 배 SDS 용해 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 다음 단계로이 시점에서 진행, 또는 편리한 때까지 -20 ℃에서 알루미늄 호일 및 저장과 번호판을 봉인 할 수 있습니다.

4. 달리기, 염색, 건조 젤

참고 : 모든 작업은 지역 DESIGNA에서 수행되어야한다방사능에 대한 테드.

1. 하이브리드 오븐의 전원을 켜고 85 ℃로 설정합니다. 실온에서 해동 판. 일단 오븐 오븐 10 분 샘플을 변성하는 동안 배양 온도, 이전 판에 도달했습니다.
2. 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 반응의 15 μL와로드 26 웰 프리 캐스트 젤은 한 번에 여러 우물을 채우기 위해. 케어는 모든 팁 대응도 전에 샘플을 추가로 정렬 않도록주의해야합니다. 이 비법 인 ATP를 포함로 추적 염료 (파란 선)은 젤의 바닥 떨어져 실행하지 못하게 150 V.에서 젤을 실행합니다.
3. 젤을 해체하고 메스하거나 영화를 과다하므로 직선을 사용하여 비법 인 ATP (파란 선)을 차단. 라벨이 붙은 용기에 젤을 놓고 15 분 동안 쿠마 얼룩 커버.
4. 간단히, 쿠마 얼룩을 제거 물 젤을 씻어 및 솔루션을 destain 추가합니다. 젤 Destain 단백질은 명확하게 볼 수 있습니다 때까지. MBP를위한 밴드 및 기판 밴드해야각 샘플에 대한 표시.
5. 젤을 건조 :
   1. 필터 큰 종이를 잘라 건조기에 놓습니다.
   2. 이 부드러운 때까지 증류수에 셀로판 시트를 적시고 무료 주름, 용지의 상단에 배치.
   3. 젤의 순서를 기록하고, 셀로판 시트의 상단에 젤을 놓습니다. 두 번째 셀로판 시트를 적시고 젤 위에 놓습니다.
   4. 좋은 균일 한 표면에 대한 모든 거품을 (플레이트 밀봉 롤러이 잘 작동) 출시. 플랩을 닫고 진공 켜고 80 ℃에서 3 시간 동안 젤을 건조.
6. 겔이 건조되면, 신호를 강화하기 위해 스크린을 사용 XAR 필름에 노출. 사란 랩 또는 비닐 봉지와 카세트를 감싸고 서리을 유지하기 위해 테이프로 밀봉. -80 ° C 하룻밤에 카세트를 저장합니다.

5. XAR 필름 개발

1. 다음 날, 냉장고에서 카세트를 제거하고 실온에서 해동을 할 수 있습니다. 의 필름 개발암실은 제조자의 지시에 따른 필름을 사용하여 프로세서.
   참고 : 키나제 기판 쌍의 증거에 대한 영화를 검사합니다. 두 번째 이상 노출도 약한 인산화 이벤트를 감지하는 데 유용 할 수 있습니다.

결과

화면에서 대표적인 결과는도 2에 도시되어있다. 180 키나아제는 CRTC2뿐만 아니라 고전 키나아제 검정 기질 미엘린 염기성 단백질 (MBP)로부터 AA 2백68부터 2백83까지 대응 GST 표지 된 펩티드 기질을 사용하여 스크리닝 하였다. 단 두 키나제, MARK2와 매우 관련 키나아제 MARK3는 CRTC2 펩타이드를 인산화. 그것은 많은 phosphorylatable 잔류 물을 포함하고 젤의 아래쪽으로, 18 kDa의에서 실행되는 MBP,...

토론

^{14,15 접근법을} 설명 원래 공보 이후, 180 GST-키나제의 원래 라이브러리는 인간 단백질 kinome 420 부재, 또는 ~ 80 %로 확대되었다. 확장 된 라이브러리와 같은 설명 프로토콜 (필요하다고 인정하는) phosphorimaging 및 디지털 신호 향상의 사용에 의해 단축 될 수있는 필름을 개발 4~5일 다음 1~4일 걸립니다. 주의를 기울여야합니다 몇 가지 주요 단계 (프로토콜의 개요를 그림 1 참조)이 있...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysis buffer	Made in house		See Protocol step 1.1
10x kinase buffer	Made in house		See Protocol step 1.2
10x M-ATP	Made in house		See Protocol step 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-tagged in house
96 well plates	Fisher Scientific	CS003595
293T cells	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
Reduced serum medium	Invitrogen	22600-050
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen	11668-019
Automated liquid dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small cassette attachment	Thermo Scientific	24073295
Standard cassette attachment	Thermo Scientific	14072670
4 mM pervanadate	Made in house		See Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
Multichannel pipette (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
Multichannel pipette (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V-bottom 6-well plates	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione coated 96-well plates	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridization oven	Biostad	350355
GST tagged substrate	Made in house
Myelin Basic Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pipette (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	Made in house		See Protocol step 1.4
26-well precast TGX gels	BioRad	567-1045	gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stain	Made in house		0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destain	Made in house		10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containers	Made in house		Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paper	Fisher Scientific	57144
Cellophane sheets (2)	BioRad	165-0963
Gel dryer	Labconco	4330150
Double emulsion autoradiography film	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensifying screen	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275