을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

요약

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

초록

전문 모바일 면역 세포의 부재에서, 식물은 현지화 프로그램 된 세포의 죽음과 전신 획득 저항성이 병원균의 공격으로부터 자신을 방어하기 위해 사용한다. 전체 식물 면역 반응 애기 특정 유전자의 기여는 구체적 정량적으로 감염된 조직 내의 병원균의 성장을 분석하여 평가할 수있다. 지난 3 년 동안의 hemibiotrophic 세균은 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae) 태양 광 발전. maculicola ES4326 (PSM의 ES4326)는 널리 애기 면역 반응의 기초가되는 분자 메커니즘을 조사하기 모델 병원체로 적용되었습니다. 잎 조직으로 병원균을 제공하는, 다중 접종 방법이 확립되어, 예를 들면, 주사기 침윤 접종 딥, 스프레이, 진공 침윤, 홍수 접종. 다음 프로토콜은 성인의 잎으로 병원성 PSM ES4326를 전달하도록 최적화 된 주사기 침투 방법을 설명하는데애기 장대 식물을 토양에서 재배하고 정확하게이 병원균으로 강화 된 질병 감수성 (EDS)을 선별. 또한,이 프로토콜은 상기 살리실산 (SA) -Triggered 내성 (STI)와 MAMP 트리거 내성 (MTI)를 포함한 식물 방어 다른 층 내의 특정 결함 면역 해부 여러 전처리를 보충 할 수있다.

서문

때문에 자신의 고착 자연, 식물은 지속적으로 다양한 라이프 스타일과 영양 전략 ^1을 나타내는 병원균의 과다에 의해 위협을 받고있다. necrotrophic 병원균 적극적으로 비밀 독소와 효소가 호스트 조직을 죽이고 죽은 세포 ^(1)에 공급하는 동안 첫 번째 근사, biotrophic 병원균, 영양분을 검색 할 수 살아 자신의 호스트를 유지한다. 병원균이라고 hemibiotrophs의 또 다른 그룹은 병원체의 축적 ⁽²⁾ 특정 임계 값에 도달시 necrotrophic 단계에 biotrophic 무대와 변화와의 감염 과정을 시작합니다. 효과적으로 이들 미생물로부터 자신을 방어하기 위해, 식물 병원체 공격을 검출 및 트리거하도록 여러 감시기구를 구비 한 복잡한 선천 면역을 진화 세포사 ^3뿐만 아니라 전신 획득 저항성 (SAR)을 ⁴ 프로그램 지역화. 현재의 연구는 필수 SIG의 특성에 초점을 맞추고naling 구성 요소와 식물 면역 체계 ⁽⁵⁾ 내에서 교차 회담.

"지그재그"모델 ^5에 제시된 바와 같이, 식물 선천성 면역 반응의 제 1 층은 미생물의 침입을 검출하는 세포막 지역화 패턴 인식 수용체 (PRRS)의 존재를 필요로한다. PRRS는 미생물 - 관련 분자 패턴 (MAMPs)를 인식하고 MAMP 트리거 면역 (MTI) ^6을 설정할 수 있습니다. 항균 PR 단백질 ^7을 코딩하는 유전자의 전사 상향 조절을 유도 외에, MTI는 세포벽에 활성 산소 종의 생산 (ROS) 반응성 질소 종 (RNS) callose 증착 포함 병원균의 성장을 저지 다양한 이벤트에 이르게 뿐만 아니라 여러 키나제 시그널링의 활성화 경로로 ^8.

지금까지 여러 MAMPs 세균 flg22 ⁹ 포함, 애기 장대에서 MTI을 트리거 확인 된 (편모로부터 유도 된 22 아미노산 단편)과 구조적 세포벽 성분 elf18 ¹⁰ (박테리아 번역 연장 인자 화 18 아미노산) ¹¹ 펩티. 성공적인 감염을 확립하기 위해 어떤 특별한 병원체가 세포 내 또는 세포 내 공간으로 비밀 독성 이펙터 단백질하는 능력을 진화, 결과적 MTI을 억제하고 이펙터 트리거 감수성 (ETS) ^{(12, 13)를 실행} 하였다. 예를 들어, 독성 이펙터가 감염된 조직 내의 ^14-16 질병 발달을 유도하는 MTI의 유사 분열 촉진 인자 - 활성화 단백질 키나제 (MAPK) 케스케이드 인산화를 비활성화 할 수있다. 호스트 및 병원체의 동적 공진화 동안 식물도 이펙터 단백질을 인식하고 병원체 병원성 ¹⁷ 분자 감쇠 역습 전략을 개발했다. 이 직간접 효과기 인식은 질병 저항 (R) 단백질 ^(18)에 의해 매개된다. T의 대부분밑단은 NB-LRR의 구성원 (염기 바인딩과 류신이 풍부한 반복) 가족 ^(19)이다. R 단백질에 의해 avirulent 이펙터의 인식은 이펙터 트리거 면역 (ETI) ⁽²⁰⁾ 특징 강력하고 광범위한 면역 반응을 유도한다. 방위 유전자 ^21의 발현과 방위의 대사 ^(22)의 생산을 유도하는 것 외에도, ETI는 종종 인접 조직 ⁽³⁾ 내로 확산되는 병원균을 제한 과민 반응 (HR)라고도 급속한 국부 프로그래밍 된 세포 사멸을 이끈다.

프로그램 된 세포 사멸 국부 ^(23)에 더하여, 플랜트 (SAR) ⁴ 전신 후천성 내성이라 장기 및 시스템 전체에 대한 면역 반응을 개시 할 수있다. biotrophic 병원체 공격시에, 식물 세포는 지방 조직과 조직 ⁽²⁴⁾ 모두에서 내인성 phytohormone 살리실산 (SA)와 PR 단백질의 생합성과 축적을 발생시킨다. T를 통해그 공정은, 준비의 높아진 상태 병원균 ^(24)의 넓은 스펙트럼에 의해 후속 감염 동안 빠른 응답을 수비 장착 가능 비감염 나뭇잎에 달성된다. SA와 같은 합성 유사체 벤조 (1,2,3) 티아 디아 졸 -7- 카르 보 티오 S의 산 메틸 에스테르 (BTH) 및 2,6- dichloroisonicotinic 산 (INA) 살리실산 화학적으로 유도 할 수있다 (SA) 외부 응용 프로그램 ^24시 -Triggered 내성 (STI). 병원성 관련 유전자 1 (NPR1)의 Nonexpressor 로컬 전신 조직 ^21,25,26 모두 SA 매개 방어 반응 동안 중요한 전사 조절로서 SA 수용체 및 기능 중 하나가 될 것으로 제안된다. 그것은 결정적 NPR1은 SAR 확립에 필요하며 NPR1의 손실 슈도모나스 syringae ²⁵ 향해 극적인 감수성에 이르게하는 것이 입증되었다.

광범위 식물의 분자량 기여를 특성화식물 병원체 상호 작용 구성 요소들은 여러 생물 검정은 ROS ²⁷ 버스트를 포함한 특정 방위를 측정하는 이벤트들은 단백질 제품 ^(21)의 증착 callose ²⁸ 방어 유전자 발현 및 축적이 개발되어왔다. 이러한 개별 분석은 식물 면역 반응의 특정 형태에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그들 중 누구도하지만, 전체 공장의 수준에서 완전한 방어 반응을 나타낼 수 없습니다. 반대로, 감염 후 병원균 성장의 정량화는 유기체 수준에서 면역 반응의 전반적인 평가를 제공합니다. 따라서, 정확하고 높은 표준화 병원균 접종 분석법의 개발 및 최적화는 애기 면역 반응에 대한 연구 및 발견을 연료로 중요하다.

슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae), 그람 음성 세균, Arabidops 포함한 공장 호스트의 범위에서 질병을 일으킬 수있는 것으로 확인되었다 phytopathogen^(29)이다. 피 - 모델 식물 병원균 시스템, 애기 장대로 syringae 상호 널리 분자 메커니즘을 기초 식물 방어 반응 ^(29)을 이해하기 위해 적용되어왔다. 지금까지 50여 P. syringae의 pathovars는 다른 종의 식물 ^(30)을 감염시킬 능력을 근거로 확인되었다 . P. syringae 태양 광 발전. 토마토 DC3000 (PST DC3000) ^(31)와 P. syringae 태양 광 발전. maculicola ES4326 (PSM ES4326) ^(32)는 두 개의 가장 널리 사용되는 광범위 특징 병원성 균주이다. 이외에도 식물에 의해 인식 및 MTI 응답을 트리거링되는 태평양 표준시 DC3000와 PSM ES4326은 MTI을 억제하고 병원균의 ^성장을 유리하게 ^{31, 33} ETS를 트리거 이펙터 병원성 단백질을 분비 할 수있다.

기능적으로 애기 장대와 경찰 사이의 상호 작용을 해부하다 syringae, 여러0; 병원체 감염 방법은 병원체 전달 방식에 기초하여 개발되었다. 토양 재배 식물, 병원균은 주사기 침투, 진공 침투, 딥 접종 및 분무 접종 ^29,34에 의해 전달 될 ​​수있다. 최근 모 홍수 접종 분석이 조직 문화에 대형 스크린을 수행하기 위해 개발 된 젊은 애기 장대 식물 ⁽³⁵⁾ 플레이트 성장. 주사기 침투는, 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나로서, 기공 ^(29)를 수동으로 ^불리는 천연 잎의 틈 사이로 apoplast으로 병원체를 제공한다. 경찰의 이러한 접근 방식을 통해, 동일한 양 syringae 감염된 잎 침투 할 수 있고, 식물 면역 반응의 강도는 반비례 병원균 성장 수준으로 상관된다. 따라서, 병원균의 성장의 정량화는 전체 공장 수준에서 면역 기능을 평가하기위한 최적의 방법 역할을합니다. 또한, 주사​​기의 침윤이 로컬 및 전신 조직을 구별 할 수있는 ㄴ 수SAR ^{(36)의 기초가되는} 분자 메커니즘의 특성에 해당하는 전자.

다음 프로토콜에서, 우리는 강화 된 질병 감수성 (EDS)에 대한 애기 장대 돌연변이 체를 선별 PSM ES4326에 최적화 된 주사기 침투 분석에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 두 애기 유전자형을 사용합니다 야생형 생태형 컬럼비아 - 0 (골-0) 식물 (제어) 및 npr1-1 기능 상실 돌연변이를 (hypersusceptible) 즉 병원성 균주 PSM ES4326 ^(37)에 감염됩니다. The npr1-1 돌연변이 티로신에 고도로 보존 된 히스티딘을 변경하고 ²⁵ 비 기능 단백질을 렌더링하는 NPR1 분자의 ankyrin 반복 합의 시퀀스 내에서 점 돌연변이를 전달합니다. 또한, 주사​​기 침윤 분석의 변형의 수는 MTI 및 STI를 포함한 면역 반응의 특정 층에서의 결함의 정량화를 허용하는지 설명된다.

프로토콜

다음 텍스트는 애기 장대에서 PSM ES4326 주사기 침투 분석을 최적화 수행하기 위해 단계적으로 프로토콜을 설명합니다. 이 분석 주요 절차는 단순화 된 플로우 차트 (그림 1)에 표시됩니다.

1. 식물 성장 조건

1. 소우 씨
   1. 느슨하게 바닥 O에서 그들을 담가 토양과 물을 냄비 가득 2 냄비 (직경 4, 높이 3.75)를 준비 / N 여분의 물을 배수하기 전에.
   2. 시트 나 다른 종이 무게 접힌 70mm 각 냄비, 50 ~ 100 애기 씨, 야생 형 골-0 또는 npr1-1 돌연변이를 뿌리고.
   3. 80-90% (그림 2A)에 상대 습도를 높이기 위해 물을 뿌려 투명 돔이있는 냄비를 커버.
2. 전체 계층화 및 동기 발아 수 있도록 72 시간 동안 4 ° C에서 냄비를 품어.
3. 표준 성장 조건에 냄비로 이동 (12 시간 빛/ 12 시간 어두운, 21 ° C, 빛의 세기 100 μmol / 평방 ^미터 / 초, 상대 습도 40 %)은 씨앗이 발아 할 수 있도록합니다. 물 응축을 방지하는 데 도움이됩니다 성장 방에 전송 직후 구멍에 2-3 생성 돔 균열.
4. 최초의 진정한 잎은 길이 2~3mm의 크기에 도달하면, 평면 흙으로 채워진 72 우물에 냄비에서 모종을 이식.
   1. 평면에서 토양 표면의 중앙에 1 깊은 함몰 만들 손가락 또는 1 ml의 피펫 팁을 사용한다.
   2. 부드럽게 가능한 한 적은 루트 손상 개별 모종을 분리합니다. 조심스럽게 집게로 그대로 뿌리를두고 모종을 선택합니다.
   3. 우울증에 이식 충격을 최소화하고 부드럽게 우울증을 채우기 위해 주변의 흙을 가볍게하기 위해 부착 된 흙 덩어리와 함께 하나의 분리 된 종묘를 놓습니다. 생물 학적 폐기물 용기에 여분의 모종과 토양을 취소하고 따라 폐기 할 것지역 생물 학적 폐기물 처리 지침.
   4. 물은 상부로부터 모종을 옮기고 완전히 80~90% 습도를 유지하기 위해 물이 뿌려 투명한 돔 평평한 커버. 다음 4 일의 아침에 돔 균열 완전히 그 날의 말을 제거, 3 일간 돔에 보관하십시오.
      주 : 파종 종자 대안 평면 토양 가득 72 웰 상 유리 피펫 2-3 종자를 전송 한 다음 4 ℃에서 48 시간 동안 1 ㎖의 0.1 % 한천을 함유하는 1.5 mL의 원심 분리 튜브에 층화 종자에 의해 수행 될 수있다. 플랫은 발아 후 1 주일 제거 될 수 투명 돔 커버 될 필요가있다. 여분 모종 잘 당 하나의 모종을 남길 수있다.
5. 20 분 동안 1 물에 아파트를 적시에 의한 워터 식물 매 2 일 후 여분의 물을 배수.
   주 : 식물에 물을위한 시간 간격이 성장 실내 습도에 따라 결정하고, 결정된 염기 있어야사용자의 식물 성장 시설의 지속적인 관찰에 D. 그들이 잘 물결 무늬가 있는지 확인하기 위해 매일 식물을 확인합니다. 단지 몇 명소, 물 물총 병 상단에서 그 식물을 건조하는 경우.
6. 또는 성장 조건 (광주, 온도)에 따라 3-5 주 이전에 해당 발달 단계 # 3.50 (장미의 크기가 50 % 최종 크기), 근처에 식물 병원균 감염 분석 (단계 3-5)을 수행합니다. 꽃이 핌 출현 (스테이지 # 5)으로 인해 나이와 관련된 저항 ^{(38, 39)의} 발병 후 식물을 감염시키지 마십시오.

문화 미디어 및 플레이트 2. 준비

1. 왕의 B (KB) 액체 배지 1 L합니다. 부드럽게 1,000 ml의 가시적 펠릿 없다 ₂ O까지 탈 H와 자기 교반 막대를 사용하여 최대 20 g proteose 펩톤 2g 및 인산 칼륨 수화물을 교반한다. 20 분주기에 액 150 ㎖ 유리 병에 나누어지는 100 ㎖ 오토 클레이브.
2. 준비KB 고체 배지와 배양 플레이트.
   1. 부드럽게 20g Proteose 펩톤, 2g 칼륨 인산염 이염 수화물 1,000 mL를 15g의 한천이 탈 H ₂ O를 저어 오토 클레이브.
   2. 그것은 미래의 응축을 최소화하고 항생제의 저하를 방지하기 위해 터치 멋진 때까지 자기 볶음 접시에 매체를 냉각. 매체에 1 M _황산 멸균 18 ml의 멸균 80 % 글리세롤과 5 mL를 추가합니다. PSM ES4326 50 μg의 ml의 최종 농도로 냉각 매체를 추가 스트렙토 마이신, 스트렙토 마이신에 대해 저항성을 전달 감안할 ^{- 1.}
   3. 접시를 붓는다. 100mm X 15mm 및 150mm X 15mm 배양 접시 : KB 미디어 판의 두 개의 서로 다른 크기를 준비합니다. 작은 페트리 접시 함유 배지는 기본 박테리아 배양 플레이트로서 기능하고, 세균이 플레이트를 계수로 큰 페트리 접시는 역할을한다.
      주 : 플레이트 카운트 박테리아, 직사각형 플레이트는를 감소시키기 위해 사용될 수있다두 배 처리는 기존의 둥근 판에 비해 플레이트 당 플롯 할 수 있기 때문에 소모품 비용.
      1. 감염 실험을하기 전에 판을 따르십시오. 스트렙토 마이신, 황산 이후까지 2 ~ 3 개월 동안 4 ℃에서 보관 KB 매체 판은 점차 항생제 활동 ^(40)를 잃는다.

3. 강화 된 질병 감수성 (EDS)

1. 1 일 - 접시에 킬 박테리아
   1. 이틀 EDS 분석하기 전에, 행진 PSM ES4326은 -80 C 글리세롤 재고 ° KB-연쇄상 구균 세균 배양 접시에와 24 ~ 48 시간 동안 28 ° C에서 품어.
2. 제 2 일 - 액체 배양 물 식물을 시작
   1. 28 ° CO / N을 ¹ 스트렙토 마이신 250 rpm으로 흔들 ^- 50 μg의 용액을 포함하는 4 ml의 액체 KB 매체 멸균 시험관에 액체 문화를 시작합니다.
      참고 : EDS 감염 분석의 경우, 유전자형 추천입니다 당 6 식물을 사용하여에디션. STI와 MTI 분석의 경우, 처리 당 유전자형 당 6 식물 권장합니다. 박테리아 접종 들어, 0.3 내지 0.6의 λ _{600 ㎚에서} 광학 밀도를 갖는 신선한 배양액을 사용하는 것이 권장된다.
   2. 마크 샘플링에 감염된 조직을 쉽게 식별 무딘 엔드 방수 마커 잎 번호 5와 6의 잎자루 (그림 1). 기공의 개구부를 강화하고 리프로 병원체 용액 입구를 촉진, 20 분 동안 바닥에서 평탄 담가 아니라 식물을 물, 그 여분의 물을 배수.
      주 : 대안 적으로, 투명한 돔 평면을 커버하고 개구 기공을 증가 2-4 시간 동안 물에 담가.
   3. 3 일 - 병원체 희석 주사기 침투
      참고 : 아침 시간 동안 병원체 감염 취약 유전자형에서 가장 뚜렷한 질병 증상의 병원균의 증식 및 개발에 최적입니다. 감염되고 유지하기 위해 모든 노력을일관된 이온 타이밍 실험 복제 간의 변동을 줄이는 데 도움 주기성 리듬과 낮의 유전자 조절 ^{(41, 42)의} 영향을 제거한다.
      1. 실온에서 2 분 동안 9,600 XG에서의 microcentrifuge 1.5 ML 튜브의 박테리아 문화를 펠렛과 상층 액을 버린다. 멸균 10 1 ml의 밀리미터의 MgCl ₂ 세균성 펠렛을 재현 탁.
         참고 : 마그네슘 양이온 (P)의 운동성 및 접착력을 향상시킬 수 있습니다 syringae ^(43). 또한, 같은 농도에서 _황산을 사용합니다. 멸균 물은 마그네슘 염 솔루션에 대한 허용 대체합니다.
      2. 50 mL의 원심 분리 튜브에 10 mM의의 MgCl ₂ 9 mL를 박테리아 현탁액을 희석 및 λ = 600 nm에서 분광 광도계로 세균의 광학 밀도 (OD)를 측정한다. 최종 _{OD600nm에서} 10 밀리미터의 MgCl ₂ = EDS 감염 분석을위한 0.0002와 박테리아를 희석.
      3. 잎 침투희석 된 세균 용액을 포함 (일반적으로 인슐린 주사기로 알려짐) 1ml의 끝이 무딘 바늘 주사기.
      4. 전체 용량의 주사기를 위로 기입하지 마십시오. 침투 과정에서 훨씬 더 잘 제어 할 수 있도록 0.5 ~ 0.6 ㎖로 그것을 입력합니다.
      5. 집게 손가락의 위에 판의 하부면을 노출하고 부드럽게 손가락의 도움으로 잎 위치를 조정. 그 압력이 균일하게 분포되어 있는지 확인하기 위해 잎 표면에 수직으로 주사기를 놓습니다. 잎 손상을 줄이기 위해 침투하는 동안 주맥 지역을 피하십시오.
      6. 천천히 세균 솔루션을 침투하는 플런저를 밀어; 리프 어두운 색으로 표시된 바와 같이 잎 엽육에 액상 항목 가시화 될 것이다. 잎의 전체 표면을 침투 시도합니다. 이것은 하나의 시도에서 달성되지 않을 경우, 다른 침윤 스폿을 선택하고, 전체 잎 표면이 피복 될 때까지 상술 된 작업을 반복한다.
      7. 완료되면, 부드럽게 별도의 병원체 용액을 제거 흡수 조직과 잎을시킨다. 시각적으로 손상 감염된 잎의 조직을 검사합니다.
         참고 : 침투가 완료된 후 원형 주사기 인상은 볼 수 없습니다해야합니다.
      8. 원래의 성장 조건으로 그들을 반환하기 전에 1 ~ 2 시간 동안 건조하기 위해 침투 식물을 남겨주세요. 다음, 물 맑은 돔 스프레이 커버 감염된 식물을 2 시간 동안, 다음 구멍에 2-3를 생성하고 감염 실험의 나머지 부분에 걸쳐 그것을 떠날 돔 균열.
         참고 : P. 이후 syringae은 동일한 시설에서 배양 다른 식물에 감염 인자를 전파의 위험이없고, 공기 병원체 아니다. 그러나, 추가 예방 조치로, 인근에 감염된 식물과 다른 실험 식물 사이의 물리적 접촉을 피하십시오. 투명 돔 플랫 취재하면 병원체 독성을 증가시키고 질병의 진행을 가속화 할 것이다.커버링 기간이 단계 및 최적의 기간이 사용자의 식물 성장 설비의 습도에 기초하여 결정되어야 위해 필요하다.
   4. 5 일 - 미디어 판을 사전 건조
      1. 냉장 유니트에서 150mm X 15mm의 KB 판을 가지고 접시에있는 기존의 물 응축을 건조. 약 24 시간 동안 실온에서 그들을 유지하여 건조 판. 이 프로세스의 속도를 높이려면 30 ~ 60 분 동안 금이 그들의 뚜껑 층류 후드에 배치합니다.
         주 :이 단계는 다음 단계에서 판의 표면에 원형의 액적 형성에 중요하다.
   5. 6 일 - 병원균의 성장을 정량화
      주 : 다음 병원체 정량화 과정이 동일한 양의 박테리아가 식물 잎의 형태를 변경 한 경우에, 특히, 리프로 전달 확인을 위해 감염 후 이전의 시점에서 수행 될 수있다.
      1. 출현 후 감염된 조직을 처리백화 현상의 감수성 유전자형에 감염된 조직의 황색으로 표시하지만, 괴사 성 병변의 개발 (그림 2B) 전에.
         참고 : 추천 샘플링 시간이 삼일 병원균 접종 후입니다. 병원균의 성장이 환경 적 요인들에 따라 달라질 수 있기 때문에, 인큐베이션의 길이는 2 ½ -3- ½ 일의 범위 내에서 변화 및 ​​사용자의 식물 성장의 시설에서 감염의 진행에주의 관찰에 의해 결정될 필요가있다.
         1. 각각의 유전자형 (그림 1) 6 연마 튜브를 준비합니다. 한 스테인레스 스틸 연마 공을 놓고 각각의 튜브에 10 밀리미터의 MgCl ₂ 멸균 500 μl를 추가합니다.
         2. 공장에서 감염된 잎을 분리하고 1 구멍 용지 펀치 (그림 1)과 잎 디스크를 펀치.
            참고 : 샘플링 오차를 최소화 동일한 위치에서 각각의 표본 잎 펀치하려고. 상단에서 리프 디스크의 샘플링잎의 권장합니다.
         3. 무작위로 집게를 사용하여 각 연마 튜브 (두 개의 서로 다른 식물에서) 2 잎 디스크를 넣습니다.
         4. 상기 튜브를 밀봉하고 10 분 동안 최대 속도로 높은 처리량 모지 나이저 (분당 1,600 획)로 조직을 균질화. 조직이 잘 균질화하고 솔루션으로 인해 감염된 잎에서 엽록소 릴리스로 녹색으로 될 때까지 필요한 경우이 과정을 반복합니다.
      2. 균질화 기다리는 동안 멀티 채널 피펫 및 피펫 저장조를 사용하여 180 μL 된 10 mM의 MgCl _2를 96 웰 배양 플레이트의 제 6 행들을 채운다.
      3. 분쇄 후, 96 웰 플레이트의 첫 번째 행으로 접지 조직 현탁액 20 μL를 전송하고 상기 액체를 위로 및 아래로 반복 피펫 팅에 의해 혼합한다. 조직의 작은 조각이 팁을 방해하는 경우, 용액의 정확한 용적을 습득 2-3 mm 정도를 클립.
         1. 상단 O에 물방울을위한 충분한 공간을 제공하기 위해플레이트, 공간 다른 행에 다른 유전형의 조직 (그림 1) F. 10 배 연속 희석을 준비하기 위해, 두 번째 행에 20 μL의 액체를 전송하고 여섯 번째 희석 될 때까지이 과정을 반복합니다.
      4. 전사 나누어 피펫 팁 (도 1)를 사용하여 150mm X 15mm KB 플레이트 상에 96 웰 플레이트에서 용액 20 μL. 가장 집중에 가장 묽은 현탁액에서 작업 할 수 있습니다.
         참고 : 번째로 희석 대부분에서 진행 것은 불필요한 희석 사이에 피펫 팁을 변경할 수 있습니다. 플레이트를 미리 잘 건조 된 경우 (일반적으로 15 ~ 30 분)에 흡수 될 때까지 전송 된 액체 방울은 매체의 위에 그대로 유지한다. 건조 시간 RT와 습도에 따라 달라집니다.
      5. 뚜껑이 금이 실온에서 접시를 닦아냅니다. 더 이상 액체가 플레이트 표면에서 관찰 할 수 없습니다되면, 뚜껑, 반전을 닫고 실온에서 플레이트 또는 28 ° C 배양기를 품어.
      6. 식민지가 표시 될 때까지 40 ~ 60 시간 동안 번호판을 품어. 판의 성장 단위 (CFU)를 형성 식민지의 예측 10 배 드롭 (그림 2C)를 반영하는지 확인합니다. 그들이 자라다과 식민지 융합 전에 박테리아를 계산합니다. 중첩 콜로니가없는 최저 희석 박테리아의 수를 결정한다. 일반적으로 선호 희석은 10 ~ 50 식민지 사이에 포함됩니다 계산합니다.
         주 : 변화는 기술 복제 사이에 존재할 수있다; 따라서, 각 복제에 대한 최저 희석 따로 결정되어야한다.
      7. 세균 증식의 레벨을 계산하기 위해, 로우 (R)뿐만 아니라, 서면으로 복제 기술 (T) 내의 세균 수의 수를 기록. 콜로니 형성 단위의 수를 결정합니다 - 식을 통해 CFU / 잎 디스크를 : CFU / 잎 디스크 = (T는 × 10 ^R / 20) 2분의 500 ×
      8. PRODU 다음 스프레드 템플릿에 데이터를 입력그래프 (도 1)에 세륨 (스프레드 시트 데이터 분석 템플릿 파일은 표 2 참조). 각 데이터 포인트는 대수 스케일에 여섯 복제 기술의 평균으로 표현된다. 오차 막대는 평균값의 95 % 신뢰 구간을 나타내는 (N = 6).
         참고 : 95 % 신뢰 구간의 산출 수단에서, 기술의 복제 수에 기초하여 조절 될 필요가있다.

4. SA-트리거 내성 (STI)

1. 주 1 : 단계 3.1에 ​​기재된 것과 동일한 절차를 수행.
2. 주 2 : 액체 세균 배양 (단계 3.2) 식물에 물을하고 시작하는 것 외에도, SA 파생 나트륨 살리 실 레이트 ^(21)의 외부 응용 프로그램에 의해 저항을 유도한다.
   참고 : 순수 SA 가난한 물 용해도가 이전의 pH 조정이 필요, 따라서이 분석하지 않는 것이 좋습니다입니다.
   1. 피에 대한 SA-매개 방어를 유도하기 위해 syringae와 미래의 감염 ^(21)에 대한 주요 ^식물,(모의)을 벌금 1 mM의 나트륨 살리 실 레이트의 안개 또는 H ₂ O 24, 스프레이 식물 병원균 감염 전에 16 ~ 24 시간.
3. 주 3 : = _{OD600nm에서} 0.001을 병원체 희석을 준비하고 주사기 침투 (단계 3.3)로 전체 잎 표면에 박테리아를 밀어 넣습니다.
4. 6 일 방법 : EDS 분석 (단계 3.4 및 3.5)에 기재 한 바와 같이 병원체 정량 및 계산 과정의 경우, 절차를 따르십시오. 접시와 카운트 H ₂ O 및 나트륨 살리 실 레이트 - 별도 전처리 샘플. 전처리 된 식물 - 야생형 애기 장대의 경우, 병원균의 성장 1-2 log 감소는 나트륨 살리 실 레이트로 예상된다.

5. MAMP 트리거 면역 (MTI)

참고 :이 분석에서 우리는 애기 장대 야생형 골-0 및 돌연변이 fls2 및 EFR 식물을 사용합니다. FLS2 및 EFR 플라즈마 막 지역화 패턴 인식 수용체 (PRRS) flg22 및 elf18가 인식 할 수있는, respe 있습니다ctively ^{9, 10.} PSM ES4326 외부 MAMP 전처리 및 주사기 침투 다음 돌연변이에 변경되지 않은 병원균의 성장에 의해 표시된다 MAMP의 특정 유형에 무감각 각 PRR 결과의 손실.

1. 제 1 일 및 2 : 단계 3.1 및 3.2에 기술 된 것과 동일한 절차를 수행.
2. 주 3 : MAMP 전처리 및 병원체 감염
   1. 의 MAMP 트리거 면역을 설정 플라 젤린 에피토프 flg22 또는 EF-화 에피토프 elf18과의 1 μm의 솔루션을 준비하기 위해 병원체 감염 (단계 3.3.3-3.3.6) 이전에 전체 잎 표면에 4 시간에 그것을 주사기를-침투. 이 피에 대한 MAMP 매개 방어의 유도를 허용합니다 syringae 프라임 미래 감염 ^6,37의 식물.
      참고 : 공개 된 마이크로 어레이 데이터는 flg22 또는 elf18 처리 ^37,44 후 4 시간을 일 MAMP 응답 유전자의 최대 전사 재 프로그래밍을 밝혔다. 따라서, 4 시간은 좋습니다골-0 MAMP 처리 및 fls2 및 EFR 돌연변이 사이의 병원균 성장에 명확한 차이를 달성 초래 MAMP 사전 치료 기간.
   2. 흡수성 티슈로 여분의 MAMP 솔루션을 제거하고 잎 내의 액체 흡수 과정을 속도를 폭로 식물을 둡니다. 주사기의 압력 침투의 부상 효과를 설명하기 위해, 제어 식물의 잎에 H ₂ O를 침투.
   3. 외경 _{600 ㎚에} 병원균 희석을 준비 = 0.001 MAMP / H ₂ O 전처리 주사기 침투하여 잎 (단계 3.3)의 전체 잎 표면에 박테리아를 밀어 넣습니다.
3. 제 6 일 : 단계 3.4 및 3.5에 설명 된대로 병원균 정량 및 계산 과정의 경우, 절차를 따르십시오. 접시와 별도로 H ₂ O와 MAMP 전처리 샘플을 계산합니다. 야생형 애기는 병원균 성장 1-2 log 감소는 다소 강한 더불어 MAMP 예비 처리 된 식물에서 예상flg22 의해 매개 ER 감소 elf18에 비해.

결과

우리가 여기서 설명하는 프로토콜 최적화 (P)를 나타냅니다 syringae 주사기 침투 분석은 정량적으로 애기 장대 식물의 면역 반응을 알아보고자 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, PSM ES4326 주사기의 침윤은 연속 희석 콜로니 열거 통해 병원균 추출 및 정량 따른다.

프로토콜 텍스트 내에서 3 단계에서 설명 된 바와 같이, ES4326 PSM에 ?...

토론

인구 available 농지 감소와 증가함에 따라, 전 세계의 연구자들은 작물 개선을위한 긴급한 필요로하는 과제를 안고 있습니다. 수율은 매우 다양한 생물학적 및 비 생물 적 스트레스에 의해 영향을받을 수있다. 그 중에서도, 병원체 감염 단독 ⁴⁵ US에서 약 12 %의 손실에 대해 책임 작물 수확량 감소의 주요 원인 중 하나이다. 이 문제를 해결하려면, 대규모 연구는 모델 애기 장대에서 진행되고?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MetroMix 360	Grosouth	SNGMM360
Large pots	Grosouth	TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts	Grosouth	LM1206
11x 21 Flats with no holes	Grosouth	LM1020
11x 21 Flats with holes	Grosouth	LM1020H
Vinyl propagation domes	Grosouth	CW-221
Proteose Peptone	Fisher Scientific	DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate	MP Biomedicals	151946
Agar	Fisher Scientific	A360-500
Streptomycin sulfate	Bio Basic Inc	SB0494
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	R80150
Rectangular plate	Fisher Scientific	12-565-450
MgCl2 Hexahydrate	Bio Basic Inc	MB0328
Glycerol	Bio Basic Inc	GB0232
MgSO4	Bio Basic Inc	MN1988
1 ml syringe	Fisher Scientific	NC9992493
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A
Grinding tubes	Denville Scientific	B1257
Caps for grinding tubes	Denville Scientific	B1254
Stainless steel grinding ball	Fisher Scientific	2150
96-well plate	Fisher Scientific	12-556-008
Sodium Salicylate	Sigma Aldrich	s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)	Genescript	Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	Genescript	Made to order
Hole puncher	Staples	146308
Biophotometer plus	Eppendorf	952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer	Fisher Scientific	02-215-503
Accu spin micro centrifuge	Fisher Scientific	13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl)	Eppendorf	3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl)	Eppendorf	3122 000.060
Pipette (20µl)	Eppendorf	3120 000.038
Pipette tips	Fisher Scientific	3552-HR
Sharpie permanent marker	Staples	507130
1.5 ml tube	Eppendorf	22363204
Forceps	Fisher Scientific	08-890