Pedunculopontine 핵 뉴런에서 녹음 감마 밴드 진동

요약

pedunculopontine 핵 (PPN)은 뇌간에 위치하고 있으며 그 뉴런은 최대한 깨어 및 빠른 안구 운동 (REM) 수면 뇌 상태 동안 활성화됩니다. 이 작품은 PPN 뉴런 시험관 감마 밴드 서브 쓰레 숄드 막 진동에 기록 할 수있는 실험 방법을 설명합니다.

초록

(; CL / PF 핵 예를 들어, centrolateral / parafascicular)을 PPN에서 시냅틱 efferents는 여러 intralaminar 시상 영역의 신경 세포의 활성을 조절하는 것으로 알려져있다. PPN 또는 생체 내에서 CL / PF 핵 하나의 활성화는 동물의 흥분과 피질 뇌파 (EEG)의 감마 대역 활동의 증가를 유도하는 것으로 설명되었다. 망상 활성화 시스템에서 감마 대역 진동의 생성을위한 세포 메커니즘 (RAS) 뉴런 다른 뇌 핵 감마 대역 진동을 생성하기 위해 발견 된 것과 동일하다. (9에서 시상 조각에서 - 이십오일 된 래트) PPN 뉴런 전류 클램프 녹음 중에 사각 단계 탈분극의 사용은 급속 -25 MV 이상의 탈 분극되는 PPN 뉴런 방지 전위 의존성 칼륨 채널이 활성화.

1 주입 - 긴 현재의 램프를 탈분극 2 초 점차 PPN 막 잠재적 인 입술을 탈 분극팅은 0 MV으로 값. 그러나, 주사 펄스 탈분극 사각형 램프에 의해 발생되는 진동에 비해 진폭이 작게 나타났다 막전위 감마 대역 진동을 생성. 모든 실험은 전압 게이트 된 나트륨 채널 및 고속 시냅스 수용체 차단제의 존재 하에서 수행되었다. 높은 임계 전압 의존성 칼슘 채널의 활성이 PPN 뉴런 감마 대역 진동 활동의 기초가 있다고 밝혀졌다. 구체적인 방법 론적 및 약리학 적 개입을 유도하고 체외에서 PPN에게 서브 쓰레 숄드 감마 밴드 진동을 유지하는 데 필요한 도구를 제공, 여기에 설명되어 있습니다.

서문

PPN 핵은 해부학 꼬리 중뇌 피개에 포함되어 있습니다. PPN은 RAS ^(1)의 핵심 구성 요소입니다. PPN은 (, 깨어있는, REM 수면 예) ² 행동 활성화 상태의 유지 보수에 참여하고 있습니다. 쥐에서 양측 PPN 병변이 감소 또는 REM 수면 ^(4)를 제거하면서 대뇌 피질 EEG ³ - (40 Hz에서 20) 생체 내에서 PPN의 전기 자극은 빠른 진동을 유발. PPN 뉴런의 대부분이 베타 / 감마 대역 주파수에서 활동 전위 발생하는 동안 (20-80 Hz에서) 일부 신경 세포가 자연 발화의 저렴한 요금을 제시 (<10 Hz에서) ^5. 또한, PPN은 동기 및 주의력 ^6과 같은 동작의 다른 측면에 관여하는 것으로 보인다. 직접 고주파 (40-60 Hz에서) decerebrate 동물 PPN 핵의 ⁷ 전기 자극은 운동을 홍보 할 수 있습니다. 최근에는 깊은 뇌 자극 (DBS)은 PPN의 아프로 앓고있는 환자를 치료하는데 사용되어왔다파킨슨 병 (PD) ⁽⁸⁾ 등의 보용 결핍과 관련된 질환 m.

이전 보고서는 사각형 전류 펄스 ^(9)를 사용하여 탈 분극 때 거의 모든 PPN 뉴런 감마 대역 주파수에서 활동 전위를 해고 할 수 있음을 보여 주었다. 때문에 MV까지 또는 -25에서 평방 펄스 depolarizations 동안 전압 - 문이 칼륨 채널의 급격한 활성화. 결과적으로, 더 강력한 감마 진동은 테트로도톡신 ^(10)을 사용하여 활동 전위의 생성을 차단 한 후에는 관찰되지 않았다. 이러한 문제를 우회하기위한 노력의 일환으로, 한 - 긴 현재의 램프를 탈분극 2 초를 사용 하였다. 부분적 전압 게이트 칼륨 채널을 비활성화하는 동안 경사로 점차 0까지 MV 값을 쉬고에서 막전위가 탈 분극. 삭제 감마 밴드 진동 막 ¹⁰ (-25 MV 및 MV -0 사이 IE) 문턱 칼슘 통로의 전압 의존성 윈도우 내에 분명 하였다. 결론적으로, 감마 밴드 activi타이 PPN 뉴런 ^9에서 관찰되었고, 모두가 P / Q- 및 N- 유형 전압 관문 칼슘 채널은 PPN ¹⁰ 감마 대역 진동을 생성하기 위해 활성화 될 필요가있다.

일련의 연구는 PPN 뉴런 높은 임계 칼슘 통로의 위치를​​ 결정 하였다. 염료의 조합을 주입 비율 적 형광 이미징 전류 램프 ^(11)를 사용하여 다른 탈 분극시 수지상 활성화되는 전압 게이트 된 칼슘 채널을 통해 칼슘 과도 현상을 보였다.

PPN 뉴런의 고유 특성 따라서 RAS 및 thalamocortical 루프 사이에 고주파 진동 신경 세포 활성을 유도 일어나고 REM 수면시에 이들 세포의 동시 활성화를 허용하도록 제안되어왔다. 이러한 장기에 도달 상호 작용은 안정적으로 지속적으로 ^{12 일에} 우리 주변의 세계를 평가 할 수있는 뇌 상태를 지원하는 것으로 간주됩니다. 여기서는 실험을 설명알 필요 조건 생성 및 시험 관내에서 세포 PPN 감마 밴드 발진을 유지한다. 이 프로토콜은 이전에 설명하지 않은, 다른 뇌 영역에서 감마 밴드 활동을 매개 고유 막 성질을 연구하는 그룹의 번호를 도울 것이다. 또한, 현재 단계에서는 감마 대역 활동이 이들 세포에서 생성 될 수있는 잘못된 결론을 초래할 수도있다.

프로토콜

모든 실험 프로토콜은 의료 과학에 대한 아칸소 대학 (프로토콜 번호 # 3593)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 관리 및 실험 동물의 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소와 일치 하였다되었다.

표준 인공 뇌척수액 1. 준비 (ACSF)

1. 주식 용액 A의 제조
   1. 화학 물질을 추가하기 전에 깨끗한 1 L 비이커에 증류수 700 ML을 추가합니다.
   2. 지속적으로 500 ML의 볼륨을 교반하면서, 염화나트륨의 136.75 g, KCl을의 6.99 g, _황산의 2.89 g과의 NaH ₂ PO _4의 2.83 g을 추가합니다.
   3. 희석 한 후 L. 최종 부피에 도달하기 위해 더 많은 증류수를 추가하고, 각 화합물의 최종 농도는 117 mM의 염화나트륨, 4.69 mM의 KCl을이고, 1.2 mm의 ₄ 황산, 1.18 밀리미터의 NaH ₂ PO _4.
   4. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 냉장 유지.
2. 스톡 용액 B의 제조
   1. 화학 물질을 추가하기 전에 깨끗한 1L 비커에 증류수 700 ML을 추가합니다.
   2. 연속적으로 500 ㎖를 교반하면서, D- 글루코스 및 41.45 _g의 NaHCO3 41.84 g을 추가한다.
   3. 희석 한 후 L. 최종 부피에 도달하기 위해 더 많은 증류수를 추가하고, 각 화합물의 최종 농도는 11.5 mM의 D 글루코오스 24.9 mM의 _{NaHCO3을한다.}
   4. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 냉장 유지.
   5. 각 실험 혼합 전에 50 50 ㎖ 스톡 B와 스톡 (A)의 용액과 연속적 carbogen (- 5 % CO ₂ 혼합물 95 % O _2)와 함께 산소로하면서 최종 농도 ACSF 용액을 수득하고 RT 떠날 증류수 1 L에 가져다 적어도 30 분. 각 실험의 시작에서 최종 농도 ACSF 준비하고 하루의 끝에 버린다.

자당 인공 뇌척수액 2. 준비(자당 - ACSF)

1. 원액 C의 제조
   1. 화학 물질을 추가하기 전에 깨끗한 1 L 비이커에 증류수 700 ML을 추가합니다.
   2. 계속해서, 증류수 500 mL를 교반하면서, 수 크로스 240 _​​g,의 NaHCO3 6.55 g, 0.671 g의 KCl,의 MgCl ₂ 4.88 g, _CaCl2를 0.22 g 및 아스코르브 산 0.21 g을 추가한다.
   3. 희석 한 후 1 L. 최종 부피에 도달 할 더 많은 증류수를 추가하고, 각 화합물의 최종 농도는 701.1 밀리미터 크로스, 78 mM의 _NaHCO3을 9 mM의 KCl을 24 mM의의 MgCl _2, 150 mM의 _CaCl2를 1.2 mM의 아스코르브 산이다 .
   4. 최대 일주일 4 ° C에서 원액의 C를 유지합니다.
   5. 각 실험 혼합 전에 연속적 carbogen (95 % O _2~5%의 CO ₂ 혼합물)와 함께 산소로하면서 최종 농도에서 자당 ACSF 용액을 수득하고 RT 떠날 증류수 600 mL를 스톡 C 50 ml를 300 ml의 적어도 30 분.

3. 슬라이스 준비

1. carbogen와 함께 산소로 동안 얼음에 100 ml의 자당 ACSF 솔루션 깨끗한 비커를 넣고 0.1 M NaOH 용액 몇 방울을 추가하는 동안 pH 미터를 사용하여 7.4에서 pH를 고정 (때의 pH <7.4) 0.1 M HCl 용액 ( pH가> 7.4).
2. 크로스 - ACSF와 vibratome의 커팅 챔버를 입력하고 산소를. 절단 챔버에 결합 된 글리세롤 기반 냉동 시스템의 전원을 켜고은 0으로 냉각 할 수 있도록 15 분을 기다립니다 - 4 ° C를.
3. (<50 μl의 최종 볼륨을 사용하여 70 ㎎ / ㎏, IP) 케타민과 (성인 초과 임신 흰쥐에서 12에 9 세) 쥐의 새끼를 마취. 강아지가 진정되면, 두 배는 꼬리 핀치 반사가없는 확인합니다.
4. 강아지 목을 벨.
   1. 탄소강 메스 블레이드를 사용하여 백업하고, 집게를 사용하여 피부면을 끌어 전방으로부터 길이 방향으로 두피를 잘라. SC를 움직이는 뇌를 덮고있는 뼈를 잘라측면 issors 완전히 뇌를 노출 제거합니다.
   2. 그런 다음, 빠르게 (처음에는 부드럽게 대부분의 꼬리 부분을 향해 가장 주동이에서 뇌를 밀어하기 위해 후각 망울 아래에 위치) 주걱을 사용하여 두뇌를 제거합니다. 조심스럽게 얼음 냉각 산소 크로스 - 인공 뇌척수액 (자당 ACSF)으로 뇌를 밀어 넣습니다.
5. (반구의 약 삼분의 제거) 오른쪽 반구에 시상 컷을 확인하고 자기 적를 포함 시상 400 μm의 섹션을 잘라 vibroslicer의 절단 실에 고정하는 금속 디스크에 뇌의 손질 측 접착제 pedunculopontine 핵 (PPN). 전체 셀 패치 클램프 녹음하기 전에 45 분 동안 실온에서 PPN 슬라이스를 유지합니다.

PPN 조각 4. 녹음 감마 밴드 진동

1. 칼륨 글루코 네이트 세포 내 용액의 조제 (하이 K ⁺ 솔루션)
   1. 에 배치증류수 10 ml의 깨끗한 비커를 아이스. K ⁺ -gluconate, 90.68 mg의 크레아틴 인산 디 트리스 소금, 47.66 mg을 HEPES, 1.5 mg을 EGTA, 40.58 mg의 마그네슘 ^{2 +} -ATP, 4 mg의 나트륨 ⁺ ₂ -GTP을 : 지속적으로 추가 교반하면서.
   2. KOH 7.3 (증류수 100 밀리미터)로 산도를 조정합니다. 20 ㎖의 최종 부피에 도달 증류수를 추가한다. 이 290mOsm - 필요한 경우, 280로 자당 (증류수 100 밀리미터)와 삼투압을 조절합니다. 희석 한 후, 각 화합물의 최종 농도는 124 mM의 K ⁺ -gluconate 인 10 밀리미터 크레아틴 인산 디 트리스 염, 10 mM의 HEPES, 0.2 mM의 EGTA, 4mM의 Mg를 ^{2 +} -ATP 및 0.3 mM의 나트륨 ⁺ ₂ -GTP.
   3. 나누어지는 세포를 1 ml의 튜브 솔루션 및 동결 -20 ° C에서. 하루에 한 나누어지는을 사용하여 실험하는 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
2. 전체 셀 패치 클램프 녹음
   1. 침지 챔버 슬라이스를 넣고 산소로 (1.5 ㎖ / 분)를 관류(95 % O ₂ - CO ₂ 5 %) 다음 수용체 길항제 함유 ACSF : 선택적 NMDA 수용체 길항제 2- 아미노 -5- phosphonovaleric 산 (APV, 40 μM)를 경쟁적 AMPA / 발생한 kainate 글루타메이트 수용체 길항제 6- 시아 노 -7- 퀴녹 살린 -2,3- 디온 (CNQX, 10μM) 글리신 수용체 길항제 스트 리키 닌 (STR 10 μM) 비 GABA _수용체 길항제 gabazine (GBZ 10 μM) 및 나트륨 채널 차단제 테트로도톡신 (TTX, 3μM)
      참고 : 결과와 수치, 이러한 길항제가 종합적으로 시냅스 차단제 또는 스케쥴링이라고합니다.
   2. 기록 패치 피펫 채우기; A를 상업적으로 이용 가능한 패치 피펫 필러를 사용하여 세포 내 높은 K ^{+ 솔루션} (저항 2-7 MΩ 1.0 mm 외부 직경 0.6 mm 내경의 일반 시판 두꺼운 벽 붕규산 유리 모세관에서 만든) 솔루션 필터. 그 앰프의 홀더에 피펫을 삽입합니다. 작은 POS 적용세 방향 밸브에 접속 된 실리콘 튜브를 사용하여 피펫 홀더에 연결된 1 mL를 주사기를 사용하여 압력을 직관적. 패치 클램프 증폭기에 피펫 홀더의 뒷면을 연결합니다.
   3. 근적외선 미분 간섭 대비 광학에 결합 된 4 배 목표를 사용하여 PPN 핵 근처의 기계적 미세 조작기를 사용하여 기록 피펫을 이동합니다.
      참고 : PPN 핵이 우수한 소뇌 꽃자루에 조각 등쪽에서 관찰 할 수있다 (SCP, 축삭의 두꺼운 번들로 관찰). 녹화 피펫은 PPN에 위치 하였다는 꽃자루의 후방 끝에 지느러미 바로 위치한 compacta을 갈 거예요.
   4. 40 배의 물에 침지 렌즈를 사용하여 시각 동안 PPN 신경 세포와 접촉하는 기록 피펫을 가지고, 그리고 신속하게 셀과 시일을 형성하는 음의 흡입을 적용한다.
   5. 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 음의 흡입 동안 피펫 저항을 모니터링 전압 클램프 인감 소프트웨어를 사용합니다.
      1. 음수의uction 서서히 증가하고, 피펫 끝으로 패치 - 클램프 모니터 판독 저항 값이 80에 도달 - 급속 MV를 -50 부압을 해제 유지 전위 변경을 100 옴. 계속 신경 세포의 막과의 전기 접속은 전체 셀 구성에서는 달성 파열까지 네거티브 흡인 적용 시작.
      2. 전압 클램프 시일 소프트웨어로 측정 접속 저항 값이 10 옴 이상이라면, 더 적은 양에서 음의 흡입을 계속인가.
   6. 용량 보상 전압 클램프 모드 및 직렬 저항 (즉, 느린 및 빠른 과도 현상은 전지의 멤브레인 파열 후에 관찰). 다리 값을 보상 빠르게 전류 클램프 녹음 모드를 전환하고 (예를 들어, 앰프 노브를 이동하거나하게 컴퓨터의 마우스를 사용하여 자동 보정 메뉴를 클릭).
      1. PPN 신경 세포의 연속 휴식 모니터합니다 막 잠재력 유를 기록중인제조 업체의 프로토콜을 노래. 탈분극 또는 hyperpolarizing 값으로 막 잠재적 인 변화를 쉬고 경우, 최적 -50 MV 최종 값을 유지하기 위해 직류 (100 pA에까지) 소량을 사용합니다.
         주 : -48 MV의 안정적인 휴식 막 잠재력 (RMP) 이상 과분극 (즉, RMP <-48 MV) 만 PPN 뉴런을 유지합니다.

결과

초기 감마 진동은 사각형 전류 펄스를 이용하여 유발시켰다. 시냅스 차단제 TTX의 존재 PPN 뉴런 전류 클램프 기록을 연속적 쉬고 막 전위는 -50 ~ MV (도 1a)에서 안정하게 유지되었다는 것을 보장하도록 모니터링 하였다. 두 번째 긴 사각형 전류 펄스는 200 Pa 이상 600 펜실베니아 (도 1a)에 그 진폭을 크게, 기록 피펫을 통해 패치 클램프 증폭기에 의해 ...

토론

PPN 뉴런은 그들이 깨어 또는 REM 수면 동안,하지만 서파 수면 ^2,3,5,13-17 중에있는 동물의 생체 내 녹음하는 동안 베타 / 감마 대역 주파수에서 활동 전위를 해고 할 수 있도록 고유 특성이 있습니다. PPN은 EEG 녹음 중에 감마 주파수를 감소 이외의 저자는 더 전방 수준에서 그 뇌간 transections을 보여왔다. 뇌간의 병변이 핵의 위치에 후부 그러나, PPN의 직접적인 자극은 EEG ^{2,3,5,18-21에}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, molecular weight = 342.30
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, molecular weight = 84.01
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, molecular weight = 74.55
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, molecular weight =  203.30
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, molecular weight = 180.16
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960	C6H8O6, molecular weight =176.12
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025	NaCl, molecular weight =  58.44
Potassium Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, molecular weight =  234.25
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight =  453.38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18
Tetrodotoxin citrate	Alomone Labs	T-550	C11H17N3O8, molecular weight = 319.27
DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid	Sigma-Aldrich	A5282	C5H12NO5P, molecular weight = 197.13
CNQX disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12
Strychnine	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, molecular weight = 334.41
Mecamylamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75
Gabazine (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23
Ketamine hydrochloride	Mylan	67457-001-00
Microscope	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
Heater	Warner Instruments	TC-324B
Pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Refrigeration system	Vibratome Instruments	900R
Equipment
microscope	Nikon	Eclipse E600FN
micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
heater	Warner Instruments	TC-324B
pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
pipette puller	Sutter Instruments	P-97
camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C