2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

요약

여기 우리를 사용 하 여 2 차원 반 변성 agarose 젤 전기 이동 법 다른 유형의 크기의 아 밀 로이드 같은 섬유의 존재를 확인 하 고 크기가 젤 동안 녹말 체 섬유의 분리로 인해 가능성을 제외 실행 중인 프로세스입니다.

초록

녹말 체 또는 아 밀 로이드 같은 섬유 많은 인간 질병과 관련 된 되었습니다 그리고 지금 많은 신호 경로 대 한 중요 한 발견 되 고 있습니다. 쉽게 다양 한 실험 조건에서 이러한 섬유의 형성을 감지 하는 능력은 그들의 잠재적인 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 많은 방법이 섬유 검출에 사용 된 있지만 몇 가지 단점이 없이. 예를 들어 전자 현미경 (EM), 또는 콩고 빨강 또는 Thioflavin T 종종 얼룩이 섬유의 정화를 요구 한다. 다른 한편으로, 반 변성 세제 agarose 젤 전기 이동 법 (SDD-나이) 정화 없이 셀 추출 물에 SDS 저항 아 밀 로이드 같은 섬유의 탐지를 허용 한다. 또한, 섬유의 크기 차이의 비교 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 서쪽 blotting에 의해 섬유 내의 특정 단백질을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 시간이 덜 소모 되 고 실험실의 넓은 수에 더 쉽게 액세스할 수입니다. SDD-나이 결과 종종 변수 정도의 표시 됩니다. SDS의 전기 이동 법 동안 복잡 한 단백질의 분리에서 결과이 부분의 여부를 문제를 발생 시킵니다. 이러한 이유로, 우리 SDD-연령 인지 확인 하려면 SDD 시대에 본 크기가 진정으로 섬유가 생체 내에서 의 결과 하지 저하 또는 일부 중 단백질의 분리의 결과의 두 번째 차원 고용 전기 이동 법입니다. 이 메서드는 빠른, 질적 확인을 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유는 SDD-나이 과정에서 부분적으로 해리 하지 않을 수 있습니다.

서문

단백질 misfolding로 인해 녹말 체 섬유의 형성이 오래 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 헌팅턴 병¹pathologic 상태에 역할을 알려져 있다. 더 최근에, 녹말 체 또는 아 밀 로이드 같은 섬유의 형성 안티 바이러스 타고 난 면역 반응² 와 necroptosis^3,4, 동안 포함 한 인간, 그리고 낮은 유기 체 신호 통로의 일부가 될 표시 되었습니다. 효 모^5,6등. 따라서, 실험실에서 이러한 섬유를 감지 하는 능력은 중요 합니다. 현재, 아 밀 로이드 및 아 밀 로이드 같은 섬유 감지 하 세 가지 주요 방법이 있다: 염료, EM, SDD-나이의 사용.

콩고 빨강 또는 Thioflavin T 같은 염료를 사용 하 여 신속 하 고 쉽게 현미경 검사 법 또는 분광학⁷를 사용 하 여 감지 되는 장점을 제공 합니다. 그러나, 현미경 검사 법, 콩고 빨강의 경우에 의해 탐지 아무 특이성을 대 한 단백질 구성 섬유 또는 섬유의 크기를 제공 합니다. 마찬가지로, 콩고 빨강 또는 Thioflavin T 바인딩 단백질 복합물을 검출 하는 분광학의 사용만 긍정적 이거나 부정적인 결과를 제공 합니다.

그들의 섬유와 섬유 길이 직경⁸에 대 한 정량적 인 정보 존재의 결정적인 증거를 제공합니다. 그러나,이 방법은 매우 엄격한 정화를 요구 한다. 또한, 그들은 비싼 장비를 사용 하 여 전문된 기술.

SDD-나이 SDS 저항 메가 돌턴 단백질 복합물 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유를 포함 하 여 검색 사용 되었습니다. 그것은 많은 이점을 제공합니다. 첫째, 그것은 섬유의 정화를 요구 하지 않는다 고 수행⁹쉽습니다. 둘째, 그것은 상대적인 크기와 양의 섬유 heterogenicity 포함 하 여 섬유의 크기에 대 한 질적 정보를 제공 합니다. 마지막으로, 서 부 럽 전기 이동 법 후 수행할 수 있습니다, 때문에 그것은 비록 그 SDD 연령 반 변성 때문에 일부 epitopes 남아 있을 수 있습니다 은폐를 주목 해야 한다는 어떤 단백질의 항 체은 존재를 검출 하기 쉽다 항 체에 의해 감지를 복잡.

최근, 수용 체 상호 작용 단백질 키 니 아 제 1 (RIPK1) 및 3 (RIPK3) 플랫폼 necroptosis, 괴 사³의 프로그램된 형태 중 신호 역할을 양식 녹말 체 섬유에 보고 되었습니다. 이러한 섬유, 공부 하는 동안 우리의 실험실 아 밀 로이드 같은 섬유⁴을 형성 하는 또 다른 necroptosis 관련 된 단백질, 혼합 계보 니 도메인 같은 (MLKL), 보였다. 그러나, 검사 SDD-나이, MLKL 섬유의 크기 (그림 1) 서로 동일한 등장 RIPK1 및 RIPK3 섬유에서 등장. 그것은 잘 알려진 MLKL necroptosis 신호 복잡 한 necrosome¹⁰라는 형태로 RIPK1/RIPK3에 바인딩합니다 때문에 이것은 예상 이었다.

적어도 2 개의 설명이 있다. 먼저, 두 개의 완전히 다른 아 밀 로이드 같은 섬유 necroptosis, 포함 한 RIPK1/RIPK3 및 다른 포함 MLKL 동안 형성할 수 있습니다. 둘째, 아 밀 로이드 같은 섬유 포함 RIPK1/RIPK3/MLKL necroptosis, 하지만 다른 단백질 MLKL의 협회 동안 형성 될 수 있습니다만 한 가지 유형의 SDD 시대 dissociates 충분히 약한입니다.

이 해결 하기 위해 수행 하는 2 차원 (2D) SDD-나이 제안 한다. SDD-나이-안정 아 밀 로이드 또는 아 밀 로이드 같은 섬유 첫 번째와 두 번째 차원 전기 이동 법 동안 동일한 마이그레이션 패턴을 갖습니다. 이것 막 단백질을 전송 하 고 서쪽 오 점 후 감지 될 것입니다. 안정적인 섬유 날카로운 대각선 패턴을 전시할 것 이다. 이에서 어떤 편차 섬유 SDS 전기 영동으로 변화 받아야 좋을 것.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 문화 2 x 10⁶ 아 밀 로이드 10 ml의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 페니실린 스-10cm 조직 문화 접시에 HT-29 결 장 암 세포를 생산. 문화 셀 5% CO₂와 37 ° C 배양 기에서 하룻밤.
   1. 세포가 80 %confluency, 성장 후 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL로 세포 세척. 트립 신 솔루션의 3 mL를 추가 하 고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.
   2. 셀 접시에서 완전히 끊 후, 문화 매체의 10 mL을 추가 하 고 10 mL 피 펫 셀 15 mL 원뿔 튜브에 전송. 실 온에서 3 분 1000 x g에서 셀 원심 매체를 발음, resuspend 문화 매체의 5 mL에 셀과 셀 카운터를 사용 하 여 셀. 두 10 cm의 각 플레이트 2 x 10⁶ 셀.
   3. 준수 하 고 5% CO₂와 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 복구를 셀 수 있습니다. 한 접시 20 ng/mL 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α), 100 nM Smac 모방 및 20 µ M 팬 caspase 억제제 Z-VAD-FMK¹¹와 amyloids의 형성을 유도 하에 치료를 적용 됩니다. 조합으로 TSZ 약식 이다. 제어로 차량 다른 요리를 취급 합니다.
2. 적절 한 길이의 시간 후 보통 6 h 세포 lysate 수확.
   1. 플라스틱 스 크레이 퍼로 접시에서 셀을 다쳤어요 하 고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브로 전송. 1000 x g 4 ° c.에 3 분에 세포를 원심
   2. 얼음 차가운 PBS의 10 mL에 resuspending 및 4 ° c.에 3 분 1000 x g에서 centrifuging 셀 2 회 세척 PBS 솔루션 발음
      참고: 프로세스 수 있습니다 수 일시 중지 여기 셀 펠 릿 액체 질소에서 냉동 고 최대 1 개월 ˗80 ° C에 저장 하 여.
   3. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 셀 펠 릿을 전송 하 고 얼음에 30 분에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 0.3 mL에서 품 어. 4 ° c.에 15 분 동안 20000 x g에서 원심 분리기 상쾌한 전체 세포 lysate 이다입니다.
      참고: 프로세스 수 있습니다 수 일시 중지 여기 몇 개월-20 ° C에서 샘플을 저장 하 여.
   4. 제조 업체의 프로토콜에 따라 Bradford 분석 실험 단백질 농도 측정. 4 x 3 µ g / µ L 샘플의 20 µ L를 준비 하 여 10 분 동안 실내 온도에 품 어 SDD-나이 로딩 버퍼를 추가 합니다.

2. 준비 하 고 실행 하는 젤

1. Agarose의 2 세대 유리 비 커에 녹기는 agarose는 전자 레인지에 열 1 x 트리 아세테이트 버퍼 (태)의 200 mL를 추가 합니다. 0.1 %SDS 최종 농도 20 %SDS 1 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 혼합 소용돌이 친다. SDS 추가 후 거품을 생성할 수 없는 주의.
2. 15 cm x 14 cm 젤 슬 래 브에 agarose 솔루션을 부 어. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 거품을 제거. 상단에서 한 20-잘 빗을 배치 합니다.
3. 첫 번째 치수: 피펫으로 60 µ g 전체 세포 lysate 맨 오른쪽 차선에서의. 실행 젤 60 V 약 4 h (염료 앞은 젤을 통해 서 약 ¾) 실행 버퍼 0.1 %SDS 포함 하는 태를 사용 하 여.
4. 두 번째 치수: 신중 하 게 회전 젤 90도 시계 반대 방향으로 (그림 2A). 60 V 약 4 h에서 젤을 실행 합니다.
   참고: 일반 실행 조건은 4 V/cm 젤 길이입니다. 실행 조건에 정확히 같은 첫 번째 및 두 번째 차원에 대 한 중요 하다.

3입니다. 전송

1. 모 세관 전송 메서드를 사용 하 여 (그림 2B) polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 단백질을 전송.
   1. 추가 전송 버퍼의 500 mL를 약 20 cm x 20 cm 컨테이너. 종이 수건 컨테이너 옆의 5 cm 높은 스택을 확인 합니다. 스택 맨의 표면적은 젤 크기 보다 커야 합니다.
   2. 전송 버퍼에 14 cm x 15 cm 필터 종이 담근 다 고 종이 수건 스택 맨 위에 배치 합니다. 주름이 나 거품 없이 종이 주의 하십시오. 필터 종이의 또 다른 조각으로 반복 합니다.
   3. 30 대 한 메탄올에 14 cm x 15 cm PVDF 막 활성화 s 다음 롤러를 사용 하 여 모든 거품을 제거 하도록 필터 종이에 레이어. 전송 버퍼와 젤을 씻어 하 고 다시 모든 거품을 압 막 위에 레이어.
   4. 전송 버퍼의 컨테이너를 플라스틱 랩과 함께 가장 가까운 종이 수건의 가장자리를 커버. 그것은 중요 한 다음 단계에서 건설 종이 다리 종이 타월 스택와 직접 접촉으로 오지 않는다입니다.
   5. 전송 버퍼에 15 cm x 35 cm 필터 종이 담근 다 고 그래서 한쪽 젤 상단 커버 하 고 다른 쪽 끝은 전송 버퍼의 컨테이너에 그것을 배치. 다른 다리와 함께 반복 합니다.
   6. 플라스틱 포장을 가진 컨테이너를 커버 하 고 실 온에서 하룻밤 둡니다.

4입니다. 서 부 럽 탐지

1. 0.05% 포함 된 PBS의 50 mL와 함께 막 씻어 20 cm × 20 cm 컨테이너에 트윈-20 (PBST). PBST에 5% 우유의 20 mL를 추가 합니다. 차단에 30 분 동안 실내 온도에 바위.
2. PBST에 5% 우유의 20 mL에 토끼 안티-MLKL 항 체의 10 µ L 플라스틱을 컨테이너에 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 로커에 품 어
3. 5 분 반복 5 번에 대 한 PBST의 20 mL에 멤브레인을 씻어.
4. PBST에 5% 우유의 20 ml 안티 rabbit-HRP의 4 µ L 플라스틱을 컨테이너에 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 로커에 품 어.
5. 5 분 반복 5 번에 대 한 PBST의 20 mL에 멤브레인을 씻어.
6. 향상 된 화학 기판 (ECL)를 추가 하 고 제조업체의 프로토콜에 따라 x 선 필름에 노출.

결과

Necroptosis 유도 후 RIPK1 및 RIPK3 거의 동일한 아 밀 로이드 같은 패턴 (2, 4, 그림 1차선)을 보여주었다. 그러나, MLKL 섬유는 더 이질적인 되었고 RIPK1/RIPK3 섬유 (레인 6, 그림 1) 보다 작은 것 같았다. 그는 RIPK1/RIPK3-독립적인 섬유를 형성 하는 MLKL 또는 MLKL 단순히 SDD 시대 큰 RIPK1/RIPK3/MLKL 섬유에서 분리 가능성을 해결 하기 위해 2D SDD-나?...

토론

2D SDD-나이의 가장 중요 한 점은 전기 조건 첫 번째 및 두 번째 차원에 대 한 동일 하다는 것. 날카로운 대각선 45 ° (분리 또는 저하 발생 했음을 나타내는) 모두 동안 동일한 방식으로 마이그레이션 하는 섬유에 따라 검색할 수 electrophoreses. 예 전압 또는 실행된 시간을 변경 하는 다른 조건을 사용 하 여 이러한 결과 모호한 것 이다. 또한, 전통적인 1 D에 대 한 경우 처럼 SDD-나이, 샘플을 끓는 피해 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
paper tower	Fisher	19-120-2484	for transfering
filter paper	VWR	21427-386	for transfering
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177	for transfering
blocking milk powder	Bio-Rad	1706404XTU	for blocking in Western blot
MLKL antibody	Genetex	GTX107538	rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody	BD Biosciences	610459	mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody	gift from Dr. Xiaodong Wang		rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	secondary antibody
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film	Fisher	F-BX810	for Western blot result
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L