전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

요약

여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 방법을 설명 합니다. 이것은 개발 조직 단면도에 또한 적용 될 수 있는 유전자 발현을 모니터링 하는 간단 하 고 빠른 절차 기관 또는 배양된 세포.

초록

Β-galactosidase, 인코딩 대장균 LacZ 유전자, 유전자 발현에 대 한 기자로 서 고 세포 계보 연구에서 추적 프로그램으로 크게 사용 된다. 클래식 조직화 학적인 반응은 쉽게 시각화 하는 불용 성 푸른 침전을 생성 하 고 철 제 2 철 이온, 함께에서 기판 X gal의 가수분해를 기반으로 합니다. 따라서, β-galactosidase 활동은 관심사의 유전자의 표현 패턴에 대 한 표식으로 개발 진행 있습니다. 여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 후속 방법 설명. 또한, 전체 배아를 명확히 하는 절차는 더 나은 X-여자 태아의 더 깊은 영역에 얼룩을 시각화 하 제공 됩니다. 반응 조건의 최적화 백그라운드 작업을 최소화 하는 데 필요한 있지만 일관 된 결과이 절차를 수행 하 여 얻을 수 있습니다. 분석 결과에 한계 고려 되어야 한다 또한, 특히 전체 마운트 얼룩에서 태아의 크기에 관한. 우리의 프로토콜 민감하고 cryostat 섹션 뿐만 아니라 모든 장기에 더 적용할 수 있는 마우스 개발 중 β-galactosidase 탐지에 대 한 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 따라서, 개발에 걸쳐 동적 유전자 표현 패턴 전체 태아에서이 프로토콜을 사용 하 여 쉽게 분석 될 수 있다 그러나 또한 세포 수준에서 상세한 식 파라핀 단면 후 평가 될 수 있다.

서문

특정 유전자 표현 패턴을 설명 하기 위해 기자 유전자 마커로 사용 초파리 에서 포유동물에 최고 되었습니다. 유전자 변형 및 녹아웃 동물 관련 된 실험, 대장균 (대장균)의 세균 β-galactosidase 유전자 (LacZ) 가장 널리 사용 되는^1,2,3, 중 하나입니다. ⁴. β-galactosidase (β-gal)의 단 (포도 당 그리고 갈 락 토스)⁵에 β-galactosides (유 당) 등의 가수분해를 catalyzes. 가장 일반적으로 사용 되는 기판은 X-여자 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galactosidase 주는 상승 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole 그리고 갈 락 토스로 분해 glycoside 했다. 첫 번째는 이합체에 산화, 사용 하는 경우 칼륨 ferri 결합-및 페로 시안 화물 생산 특성 불용 성, 파란색 침전 (그림 1)⁶.

LacZ 유전자 이상 30 년 전 리포터 유전자로 사용 될 시작^7,8. LacZ 삽입은 일반적으로, 그것은 내 생의 추적으로 유전자 변형 동물에서 뿐만 아니라 특정 삽입, 포함 된 셀을 시각화 하기 위해 박테리아와 세포 문화에 사용 될 수 있도록 열려있는 독서 프레임 대신 생 발기인의 하류 유전자 개발⁹중 식 패턴입니다. 이와 관련, β-galactosidase 활동의 시각화는 광범위 하 게 사용 되었다 초파리 에서 전체 조직에 단일 셀에서 개발 및 세포 프로세스를 이해 하. 초파리 유전학 부탁 있는 LacZ 는 취재 원 유전자를 포함 하는 수정 된 P 요소 구문 삽입 위치는 게놈에 무작위로 안정적인 라인의 세대. 따라서, 증강 요소의 영향 아래에 배치 하는 경우 그것은 수 있습니다 드라이브의 식을 조직 특정 방식으로, 지난 2 년간¹⁰동안 많은 유전자의 표현 패턴의 체계적인 분석을 허용 했다. 또한, 유전자 변형 생쥐 LacZ 유전자 발현 모니터링의 사용 또한 수 있습니다 Cre loxP 유전자 재조합 이벤트의 중재 재결합, 그리고 공상 분석 ^{돌연변이 배아 줄기 세포 유래의 지역화 11}, 용이 하 게 특정 조직에 LacZ 식의 제어 뿐만 아니라 일시적으로. 전체 배아의 β-galactosidase 활동의 일시적인 유전자 발현 ^{에서에서 분석에 다른 발달 단계에 걸쳐 편리 하 게 관찰 될 수 있다 다른 농도에서 차동 얼룩 패턴을 생성 될 수 있습니다 또한, 8,12}.

이 문서에서는, 선물이 X gal 통해 유전자 발현을 시각화 하는 프로토콜 마우스 배아의 초기 발달 단계에서 전체 산 조직에 얼룩. 우리는 파라핀 조직 또는 배아를 포함 하는 후 전체 산 표본 또는 세포 수준에서 레이블이 지정 된 셀의 정확한 탐지를 호의 매우 민감하고 저렴 한 기술로이 조직화 학적인 방법 제시. 메서드를 사용 하면 다른 방법¹³와 비교할 때 최소 배경과 마우스 조직에 얼룩의 직접적인 시각화 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 최소한의 동물의 고통을 CNIC (센트로 나시오날 드 Investigaciones Cardiovasculares)과 지방의 Autónoma 드 마드리드의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. (E12.5에 E8.5)에서 임신 쥐에서 배아의 수집

1. 자 궁 경관 탈 구 또는 CO₂ 흡입에 의해 임신 쥐를 희생. 첫 번째의 하루 질 플러그 배아 여겨졌다 관찰 하루 0.5 (E0.5).
2. 흡수 성 패드에 부정사 위치에 동물을 70% 에탄올과 마우스의 복 부 피부를 청소.
   참고: 무 균 다음 단계에는 필요 하지 않습니다.
3. 꼬 집 고 마우스 이빨 집게를 사용 하 여 복 부 피부.
4. 피부와 복 부 벽, 수술가 위를 사용 하 여 복 부의 중간에 걸쳐 수직으로 2 ~ 4 cm을 통해 절 개를 확인 합니다.
5. 복 부를 노출 하 고 수술가 위는 자 궁의 안쪽 곡률에 따라 혈관 절단 집게 어머니 로부터 자 궁 뿔 제거.
6. 배아의 문자열을 제거 하 고 10 mL 차가운 0.01 M 인산 염 버퍼 염 분 pH 7.4 (PBS)를 포함 하는 얼음의 페 트리 접시 전송.
7. 신중 하 게 10 mL 신선한 얼음 처럼 차가운 PBS와 페 트리 접시에 stereomicroscope 아래 자 궁에서 밖으로 태아를 해 부. 다음 동봉 된 배아와 노 른 자 sac는 집게의 팁을 사용 하 여 제거 하는 양수 막 눈물을 양수 골목, 노출 시계 집게와 근육 벽을 잡고.
8. (E12.5에 E8.5)에서 초기 단계에서 littermate 배아 임신 쥐에서 수집 (그림 2).
9. 10 mL 감기 1 x PBS 곡선된 겸 자 사용 하 여 신선한 요리에 배아를 전송 하거나, 매우 작은 태아 (E8.5-E9.5)를 사용 하 여 플라스틱 전송 펫 태아 손상 없이 샘플을 수집.
10. 시작 하기 전에 고정, 태아의 작은 조각을 절단 또는 시계 셉 (E9.5에 E8.5)에서 가장 작은 태아에서 양수 막 복용 배아 샘플 유전형 microcentrifuge 튜브에 걸릴.
    참고: LacZ 유전형 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 뇌관에 의해 결정 됩니다: 앞으로, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; 반대로, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2입니다. 마우스 배아의 고정

1. 1 mL 1 x PBS를 포함 하는 둥근된 기지와 2 mL microcentrifuge 튜브에 각 배아를 전송.
   참고: 회전 통을 사용 하 여 동요와이 튜브에 프로토콜에서 모든 단계를 수행 합니다.
2. 나머지 혈액을 제거 하기 위해 실내 온도에서 1 분 동안 1 x PBS에 배아를 씻어. 튜브에 액체를 변경 하려면 사용 플라스틱 전송 펫.
3. 얼음에 0.125% 글의 1 mL에 태아를 수정.
   참고: 고정 시간 태아의 크기에 따라 달라 집니다: E8.5 E9.5 배아, E10.5 배아 및 E12.5 배아에 대 한 1 시간 30 분에 대 일 분.
4. 정착 액을 제거 하 고 X-여자 얼룩에 대 한 샘플을 처리 하기 전에 실 온에서 10 분 동안 두 번 1 x PBS에 배아를 세척.

3. 전체 산 β-galactosidase Histochemistry 마우스 배아의

1. 준비 X Gal 린스 버퍼와 절차를 시작 하기 전에 X Gal 얼룩이 솔루션 ( 표 1 및 재료의 표참조). 야생-타입 (WT) littermate 배아를 사용 하 여 효소 반응에 대 한 부정적인 컨트롤.
2. (그림 2) 실 온에서 10 분 X Gal 린스 버퍼에 태아를 품 어.
3. 빛에서 보호 하는 37 ° C에서 하룻밤에 2 h에서 X Gal 얼룩이 솔루션에 태아를 품 어. 블루 얼룩의 충분 한 강도 태아에서 배경 없이 관찰 될 때까지 색상 반응 해 현미경을 통해 정기적으로 모니터링 합니다. 8과 동안을 줄이기 위해 배경 전체 얼룩 9 사이의 솔루션의 산도 유지. 얼룩 솔루션 빛을 시작, 신선한 기판 솔루션 효소 반응 확장을 교체.
4. 원하는 신호는 각각 실 온에서 10 분에 대 한 두 번 1 mL 1 x PBS 가진 microcentrifuge 관에서 배아를 세척 하 여 얻어진 반응 중지.
5. 4 ° c.에 하룻밤 1 h 1 mL 4 %paraformaldehyde (PFA) 다시 들을 수정, 스테인드 배아 전송
   참고: 배아는 4%에 저장할 수 있습니다 PFA/PBS 4 ° C에서 더 긴 시간에 대 한 단면에 대 한 즉시 처리 될 수 있습니다. 이 마지막 정착 단계 얼룩 패턴의 장기 보존을 위해 결정적 이다.
6. 실 온에서 10 분 동안 두 번 1 mL 1 x PBS에 배아를 씻어.
7. 옵션 1: 일련의 글리세롤 (1 x PBS에 20%, 40%, 60% 및 80% 글리세롤) 각 솔루션에 실 온에서 1 h의 농도 증가 함께 해결책에 있는 침수에 의해 태아를 선택을 취소 합니다.
   참고: 긴 시간 동안 80% 글리세롤에 배아를 세척도 일 때까지 그들은, 삭제 하 고이 단계 (그림 2)에서 4 ° C에서 80% 글리세롤에 그들을 저장. 글리세롤 또는 1 x 4 ° C에서 저장 된 배아에 아메리카의 나트륨 아 지 드 오 라 크리스탈의 아주 작은 금액을 추가 PBS 형 성장을 방지 하기 위해 좋습니다. 개간, 후 전체 마운트 배아 (4 단계) 촬영을 위해 사용할 수 있습니다.
8. 옵션 2: 파라핀 포함 하 고 톰 (그림 2)를 사용 하 여 단면에 대 한 배아를 처리 합니다. (4, 5 단계)를 구분 하기 전에 전체 스테인드 배아에 식 패턴을 문서화 합니다.

4입니다. 전체 산 태아의 사진

1. 전체 산 단면 전에 태아를 얼룩이 사진, 페 트리 접시의 기초와 준비에 그들을 전송 1 x PBS에서 1-2 %agarose 경화.
2. 완전히 탈수 및 액체를 통해 촬영 하는 동안 반사 방지 하기 위해 agarose 코팅 요리에 10 mL 1 x PBS 가진 배아를 커버.
3. 집게를 사용 하 여 1 x PBS에 배아 찾으시는 오래 된 배아 (E10.5-E12.5), 배치 하 고 다른 각도에서 그것에서 견본을 위치 하 고 동안을 피하기 위해는 부동성 사진 집게와는 agarose 작은 구멍을 확인 합니다.
4. 전송된 (아래 단계) 빛을 사용 하 여 stereomicroscope 단계에 접시를 놓습니다. ' 다크 필드 '와 ' 밝은 필드 ' 조정 사진 중 원하는 조명 설정 하 고 최적화 하는 샘플의 반투명을 변경 합니다.
   참고: 파이버 광섬유 조명 나중 단계 배아에 대 한를 사용 하 여 태아의 표면에서 반사를 피하기 위해. 지운된 태아 촬영 때 동일한 절차에 따라 하지만 100% 글리세롤을 포함 하는 배양 접시에 그들을 전송 하 고 완전히 그들을 담가.

5. 파라핀 포함 하 고 X-여자의 단면 스테인드 배아

1. 파라핀 왁 스 포함
   1. 4 ° C (3.5 단계)에서 배아 스테인드 X gal을 제거 하 고 그들을 씻어 1 mL 1 x PBS와 세 번 정착 액의 과잉을 제거 하.
   2. 집게를 사용 하 여 조직학 카세트에 각 배아를 전송 합니다.
   3. 비 커에 배아를 포함 하는 카세트를 놓고 다음 실 온에서 등급된 에탄올 시리즈를 통해 전달 하 여 탈수: 70% 에탄올, 한 번 30 분; 96% 에탄올, 각; 30 분 동안 두 번 30 분 동안 두 번 100% 에탄올
      참고: 배아 저장할 수 있습니다 70% 에탄올에서 탈수 과정을 시작 때까지 4 ° C에서 알 수 없는 시간에 대 한.
   4. 실 온에서 30 분 동안 소 프로 파 놀에 전체 카세트를 품 어.
   5. 집게를 사용 하 여 미리 데워 진된 소 프로 파 놀을 포함 하 여 물 얼룩 유리를 카세트를 전송 하 고 오븐에서 30 분 동안 60 ° C에 두고.
   6. 새로운 유리 50% 소 프로 파 놀의 혼합물을 포함 하 여 물 얼룩에 카세트를 배치 / 50% 파라핀 왁 스를 녹아 하 고 60 ° C 오븐에서 4 h 떠나.
   7. 녹은 파라핀 왁 스, 60 ° C에서 30 분의 변화 2와 배아와 카세트를 품 어.
   8. 최종 파라핀 세척의 끝에, 카세트 열고 몰드는 stereomicroscope 아래 샘플을 볼 수를 포함 하는 별도 조직에 각 배아를 전송 합니다.
   9. 60 ° c.에 녹은 파라핀 왁 스로 잘 채우기 열띤된 집게를 사용 하 여 녹은 왁 스를 유지 하 고 신중 하 게 금형에 배아를 찾으시는.
      참고: 샘플의 적절 한 방향을 원하는 평면에서 배아를 단면에 대 한 중요 한 단계입니다.
   10. 금형에 파라핀 굳은, 전에 블록 위에 뚜껑 없이 카세트 놓고 녹은 파라핀 왁 스와 함께 작성 합니다. 하룻밤 실 온에서 경화 될 때까지 나머지 왁 스 식 지.
   11. 파라핀은 완전히 경화, 일단 금형에서 고체 블록을 제거 하 고 단면¹⁴까지 실내 온도에 또는 4 ° C에 파라핀 블록 저장.
2. 파라핀 단면
   1. 동양에 톰 블레이드 하 고 5-7 µ m 두께의 설정. 5.2.2. 시원한 얼음에 파라핀 블록 하 고 큐브 또는 피라미드 트림.
   2. 녹은 왁 스의 작은 금액을 사용 하 여 블록 톰 홀더를 연결 합니다.
   3. 최적의 절단에 대 한 블록을 방향을 정하십시오. 표준 톰을 사용 하 여 실 온에서 5-7 µ m 두꺼운 조각으로 파라핀 블록 섹션.
   4. 좋은 붓을 사용 하 여, 조작 하 고 슬라이스 선택에 대 한 실 온에서 물 욕조에 섹션을 배치 합니다.
   5. 현미경 슬라이드와 물 탕에서 섹션을 선택 하 고 스트레칭을 위한 42 ° C에 물 목욕으로 그들을 전송.
   6. 물 목욕에서 섹션을 제거 하 고 부드럽게 접착 현미경 슬라이드에 그들을 배치.
   7. 건조 오븐에서 37 ° C 하룻밤 수 있도록 완전히 준수 섹션에서 슬라이드, 그렇지 않으면, 그들은 얻을 수 있습니다 손실 얼룩이 지는 동안.
      참고: 절차를 얼룩 시작까지 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.
3. Deparaffinization 및 X Gal 스테인드 파라핀 섹션의 Counterstaining
   1. 현미경 슬라이드 트레이 더 액체 파라핀 왁 스를 만들기 위해 적어도 45 분 동안 60 ° C에서 오븐에서에 슬라이드를 넣어.
   2. 전송에 랙 슬라이드 및 유리 얼룩 요리를 사용 하 여 다음 단계를 수행: 감소 하는 완전 한 파라핀 제거 및 조직의 수 분 농도의 알콜을 포함 하는 얼룩 항아리에 랙 잠수함: 소 프로 파 놀에서 5 분 60 ° C; 소 프로 파 놀 3 분;에 대 한 2 분;에 대 한 100% 에탄올 96% 에탄올 1 분; 실 온에서 1 분의 70% 에탄올
   3. 없는 알코올 잔류물 있는지 확인을 두 번 증류수에 섹션 린스.
   4. (예를 들어 핵-빠른 레드 솔루션) 실내 온도 (그림 2)에 (3-8 분) 사이 보통 5 분에 대 한 얼룩으로 섹션 counterstain
      참고:이 얼룩 섹션에서 전체 조직 구조를 밝히는 데 도움이 됩니다.
   5. 얼룩, 후 1 분 증류수에 슬라이드를 세척 하 고 현미경에 얼룩 섹션을 확인 합니다.
      참고: 원하는 착 색 하는 것이 너무 약한 경우 counterstain 섹션 다시 긴 시간.
   6. 에탄올의 농도 증가 함께 다음 시리즈에서 섹션 탈수: 2 분에 대 한 95% 에탄올에 두 세척,이 분 각, 100% 에탄올에 씻어 하 고, 파란색을 해산 하지 않으려면 색 침전 물, 크 실 렌에서 한 빠른 세척.
   7. 랙 하나 하나에서에서 슬라이드를 제거 하 고 종이의 조각에 그들을 배치. 다음 산과 coverslip 각 합성, 영구 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드.
      참고: 크 실 렌의 증기는 자극 하 고 인간의 건강 및 수생 생물에 유해 인화성 제품 이다. 그것은 후드 내에서 조작 하 고 적절 한 보호 장비를 사용 해야 합니다.

결과

여기 우리는 X-gal을 사용 하 여 전체 마우스 배아 (그림 1 및 그림 2)에서 기판으로 β-galactosidase 조직화 학적인 반응에 대 한 표준 프로토콜을 적용 결과 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 우리는 서로 다른 배아 발달 단계 (E9.5, E11.5, 및 E12.5)에 막 유형 4 매트릭스 metalloproteinase (Mt4-mmp) 식 검사 LacZ 기자는 내 생의 통제를 표현 ...

토론

대장균 LacZ 유전자 널리 사용 되었습니다 유전자 표현 패턴의 연구에 기자로 서의 높은 감도 및 검출의 용이성. 현재 프로토콜은 간단 하 고 저렴 한 뿐만 아니라 수행 하는 효소 반응에 따라 β-gal 식 탐지 하기 위한 고전적인 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 또한 전체 마운트 배아, 그대로 장기, cryostat 조직 섹션 또는 배양된 세포에서 중요 수정 없이 적용할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	24137-1L-R
Agarose	SCHARLAU	50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium	VECTOR LABS	H-5501
Synthetic mounting media	MERCK	100579
96% Ethanol	PROLABO	20824365
99.9% Ethanol absolute	SCHARLAU	ET00021000
50% Glutaraldehyde solution	SIGMA-ALDRICH	G6403-100ml
85% Glycerol	MERCK	104094
99.9% Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5516
Magnesium chloride hexahydrate	SIGMA-ALDRICH	63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40)	SIGMA-ALDRICH	542334
Nuclear Fast Red counterstain	SIGMA-ALDRICH	N3020
Paraffin pastilles	MERCK	111609
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets)	SIGMA-ALDRICH	P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate	MERCK	1049840500
Potassium ferrocyanide	MERCK	1049731000
Sodium azide	SIGMA-ALDRICH	S8032
Sodium deoxycholate	SIGMA-ALDRICH	30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	SIGMA-ALDRICH	106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate	SIGMA-ALDRICH	71638
Thymol	SIGMA-ALDRICH	T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl)	SIGMA-ALDRICH	10812846001 (Roche)
X-GAL	VENN NOVA	R-0004-1000
Xylene	VWR CHEMICALS	VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm	SAKURA	4566
Rotatory Microtome	Leica	RM2235
Cassettes	Oxford Trade	OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mm	VWR	ECN631-1575
Microscope slides	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER	AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER	J1820AMNZ
Flotation Water bath	Leica	HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades	Feather	UDM-R35
Paraffin oven	J.R. SELECTA	2000205
Wax Paraffin dispenser	J.R. SELECTA	4000490
Stereomicroscope	Leica	DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL	SIGMA-ALDRICH	T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL	SIGMA-ALDRICH	T9661
Orbital shaker	IKA Labortechnik	HS250 BASIC
Stirring Hot Plate	Bibby	HB502
Vortex Shaker	IKA Labortechnik	MS1
Laboratory scale	GRAM	FH-2000
Precision scale	Sartorius	ISO9001
pHmeter	Crison	Basic 20
Optic fiber	Optech	PL2000