비 간염 293T-NE-3NRs 세포에 있는 B형 간염 바이러스 감염을 모델링

요약

이 원고는 인간 NTCP, HNF4α, RXRα 및 PPARα를 발현하는 새로운 엔지니어링 293T-NE-3NR및 전통적인 간 세포(HepG2-NE, 인간 NTCP를 표현하는 HepG2-NE)에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

HBV는 주로 인간 간세포를 감염하지만 신장과 고환과 같은 외형 조직을 감염하는 것으로 밝혀졌습니다. 그럼에도 불구하고, 세포계 HBV 모델은 기능성 HBV 수용체, 타우로콜라산 나트륨 공동 수송 폴리펩티드(NTCP)를 과발현하는 헤파종 세포주(HepG2 및 Huh7와 같은)로 제한됩니다. 여기서, 우리는 293T-NE-3NR (인간 NTCP, HNF4α, RXRα 및 PPARα)와 HepG2-NE (HepG2 과발현 NTCP)를 모델 세포주로 사용했습니다.   이들 세포주에서 HBV 감염은 HepG2.2.15로부터 농축 HBV 바이러스 입자를 사용하거나 표적 세포주를 이용한 HepG2.2.15를 공동 배양함으로써 수행되었다. HBcAg에 대한 HBcAg 면역 형광은 HBV 감염을 확인하기 위해 수행되었다. 여기에 제시된 2개의 방법은 우리가 비 간 세포주에서 HBV 감염을 공부하는 것을 도울 것입니다.

서문

B형 간염은 20억 명 이상의 사람들의 삶에 영향을 미치며 공중 보건에 대한 주요 위협 중 하나입니다. 약 2억 5,700만 명이 전 세계적으로 B형 간염 바이러스(HBV)에 만성적으로 감염되어 사회^1에큰 부담을 주고 있다. 간세포는 신장 및 고환과 같은 비간 조직에서 HBV 및 기타 세포에 감염된 유일한 세포가 아니며, 또한 이 바이러스^2,,3에의해 감염된다. 현재, HBV 감염 세포 모델은 단지 몇몇 비간 세포주 모형을 가진 인간 간세포로 제한됩니다. 이것은 비 간 조직의 HBV 감염 그리고 HBV 관련 병리학의 연구 결과 방해합니다. 여기서 우리는 비간 293T 세포뿐만 아니라 간종 기반 세포에서 HBV 감염을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

타우로콜라산 나트륨 공동 수송 폴리펩티드(NTCP)는 인간 B형 간염 및 D형 간염 바이러스^4를위한 기능성 수용체이다. 간세포 핵인자 4α(HNF4α), 레티노이드 X 수용체 α(RXRα) 및 과옥시성 증식체 활성화 수용체 α(PPARα)는 HBV의 바이러스 성 트로피주의를 제한하는 간 농축 전사 인자이다. 그들은 HBV 유전체 RNA 합성을 촉진하고 비 hepatoma 세포주^5에서HBV 복제를 지원하기 위해 검증되었습니다. 우리는 NTCP (HepG2-NE), NTCP (293T-NE) 및 4개의 숙주 유전자를 표현하는 293T 세포주를 표현하는 3개의 상이한 세포주를 건설했습니다; NTCP, HNF4α, RXRα 및 PPARα (293T-NE-3NRs). HBV 감염을 위한 2개의 방법은 293T-NE-3NR(도 1)에기초하여 개발되었다. 첫 번째 방법은 24h에 대해 높은 바이러스 게놈 동등성 (높은 GEq (150), DMSO 및 PEG8000)를 가진 293T-NE-3NRs에서 접종을 사용합니다. 두 번째 방법은 HepG2.2.15와 함께 293T-NE-3NR을 공동 배양하여 DMSO 및 PEG8000 없이 HBV 입자(약 1.83)를 생성할 수 있으므로 자연 조건을 밀접하게 모방합니다.

HepG2.2.15 세포는 HepG2 선으로부터 유래되고 만성 적으로 전염성 HBV를 분비하고, 서브바이러스 입자를 배양^배지6,7로유도한다. 사이클로스포린 A(CsA)는 제노이식 거부억제에 임상적으로 사용되는 면역억제제이다. 연구 결과에 따르면 CsA는 NTCP의 수송 활성을 억제하고 NTCP의 결합을 큰 봉투 단백질^8에차단함으로써 배양 된 간세포로HBV 입력을 억제하는 것으로 나타났습니다.

HepG2-NE 세포는 CsA 처리 된 세포가 음의 대조군으로 사용되는 반면 양성 제어로 사용되었습니다. 긍정적이고 부정적인 대조군과 비교해서, 우리는 HBV 감염에 있는 중요한 역할을 하는 호스트 유전자를 알아낼 수 있습니다. 추가적으로, HBV 감염의 이 모드를 통해, 우리는 또한 HBV 감염에 관련시킨 그밖 새로운 기계장치 또는 호스트 유전자를 찾아볼 수 있습니다.

프로토콜

국내 생물안전 지침에 따라 HepG2.2.15 세포 및 HBV 감염으로부터 의 수퍼내트 수집은 생물안전 수준 II(P2) 또는 생물안전 수준 III(P3) 실험실에서 수행되어야 한다. 실험실 안전 관행은 실험실 직원의 안전을 보장하기 위해 따라야하며, HBV 실험을 수행하기 전에 모든 예방 접종 및 HBsAb 양성 검출해야합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 모든 단계에서 세포의 상태를 관찰하십시오. 인간 혈청 샘플은 산투대학 의과대학의 기관심사위원회가 승인한 승인에 따라 사용되었다.

1. HepG2.2.15 세포 배양

참고: HepG2.2.15 셀 상수, HepG2.2.15 셀 상주 농축액 및 HepG2.2.15와 접촉하는 모든 팁, 플라스크, 플레이트 및 튜브는 하룻밤 사이에 2 % 비루에 담근 후에 폐기되어야합니다.

1. 액체 질소로부터 HepG2.2.15 세포를 함유한 바이알을 제거하고 37°C 수조에서 유리병을 부드럽게 소용돌이치면 해동한다.
   참고: 오염 가능성을 줄이려면 캡을 물 밖으로 내보세요. 해동은 빠르다 (약 2 분).
2. 세포가 해동되는 즉시 수조에서 유리병을 제거하고 70 %의 에탄올로 소독하십시오.
   참고: 이 시점부터 엄격한 무균 조건하에서 모든 단계를 수행합니다.
3. 세포를 25cm² 조직 배양 플라스크로 옮기고 완전한 배양 배지4mL를 추가합니다(10% FBS, 페니실린 100 U/mL, 연쇄상 구균0.1 mg/mL함유 DMEM). 5% CO_2를가진 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양한다.

2. HepG2.2.15 세포 배양 상수 의 컬렉션

1. 배양 HepG2.2.15 T25 플라스크에서 37°C, 가습 인큐베이터에서 5% CO_{2. .} 3일마다 매체를 변경합니다.
2. 50mL 원심분리기 튜브에서 세포 상피물을 수집합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 파라핀 필름으로 감쌉니다.
3. HepG2.2.15 상체를 -20°C에 저장하여 HBV 바이러스를 활성 상태로 유지합니다.

3. 집중 HepG2.2.15 상판

1. -20°C에서 HepG2.2.15 상체를 제거하고 4°C에서 해동하십시오.
2. 세포 조각을 제거하려면 0.45 μm 멤브레인을 새로운 50mL 원심분리기 튜브로 HepG2.2.15 상체를 필터링합니다. 먼저, 바이러스를 필터링하기 전에 10% FBS로 DMEM10mL을 필터링한 다음 세포 배양 상류제를 필터링하여 필터를 차단합니다.
3. 바이러스 농축기 컬럼에 여과된 상체 14mL을 추가하고 뚜껑을 닫습니다. 수평 회전 원심 분리기에서 35 분 동안 3,200 x g의 컬렉토리를 원심 분리합니다. HepG2.2.15 상체 농축액(약 200 μL)을 1.5mL 튜브로 수집합니다.
4. DMEM의 200 μL을 추가하여 한 번 DMEM으로 컬럼을 세척하고 1.5 mL 튜브로 수집합니다.

4. 슈퍼 네이티드 농축액에서 HBV DNA 의 검출

1. 드라이 블록 히터를 켜고 온도를 100 °C로 설정합니다.
2. HepG2.2.15 상체 농축액에서 HBV DNA의 농도가 표준 곡선 범위 내에 있는지 확인하기 위해 HepG2.2.15 상내 농축액의 10 μL을 1.5mL 마이크로센드리스유게 튜브에 190 μL로 추가하여 농축액을 20배 희석시. HepG2.2.15 상수의 200 μL을 추가, 네거티브 컨트롤(건강한 기증자로부터 HBV-음성 세럼), HBV 양성 제어(HBV 환자로부터 HBV 양성 세럼) 및 키트에 제공된 정량적 참조 4개(2.0 x 10^6,2.0 x 10^5,2.0 x 10^4,2.0 x 10³ GEq/mL) 각각 1.5m)를 분리하여 1.5m)로 분리하였다.
3. 키트에서 위의 8개의 1.5mL 튜브에 450 μL의 HBV DNA 추출 버퍼를 추가하고, 15s의 소용돌이를 10초 동안 스핀다운하고 10s. 인큐베이트에서 100°C에서 10분 동안 드라이 블록 히터로 스핀다운한다. 실온에서 5 분 동안 12, 000 x g의 원심 분리기.
4. PCR 마스터 믹스 27 μL과 Taq 폴리머라제 효소 3μL을 얼음 위에 놓인 PCR 튜브에 추가합니다.
   참고 : 키트에 제공되는 PCR 마스터 믹스는 HBV DNA의 보존 된 영역에 대한 프라이머를 포함합니다.
5. 얼음 위에 놓인 PCR 튜브에 원심 분리 된 상피 액체 20 μL을 추가합니다. 단단히 덮고 10 s를 위해 아래로 회전합니다.
6. 실시간 PCR 기계에 다음 조건을 사용하십시오: 93°C 2분, 45초 동안 93°C의 10사이클, 60s에 대해 55°C; 이어서 30s용 93°C의 30사이클이 45s용 55°C로 실시간 PCR을 수행하였다.
   참고 : 상업 키트에 제공되는 마스터 믹스는 HBV DNA의 보존 된 영역에 대한 프라이머가 있습니다.
7. 얻은 Ct 값을 내보내고 표 1 및 그림 2에표시된 대로 표준 곡선을 생성합니다.
8. 표준 곡선을 기반으로 표 2에도시된 바와 같이 20배 희석된 HepG2.2.15 상피 농축액의 HBV DNA 농도를 계산한다. HepG2.2.15 상수 농축액의 HBV DNA 농도를 계산한다(표2).
9. HepG2.2.15 상체 농축액을 알리쿼트에 나누고 사용전까지 -80°C에 저장한다.

5. HepG2-NE 및 293T-NE-3NRs 세포의 체외 감염

1. DMEM/F-12에서 다음 감염 배지 준비: 10% FBS, 4 mM 글루타민 보충제, 0.1 mM NEAA, 1 mM 나트륨 pyruvate, 100 U /mL 페니실린, 100 μg /mL 연쇄 상감신, 1 μg /mL puromycin, 40 ng/mL dexamethashasone, 20 μg/mL 하이드로코테오네 및 mL 수수로 코레소네 5g. 4 °C에 보관하십시오.
   참고: 이러한 NTCP 양성 세포는 푸오마이신 내성^9.
2. 각 우물에 48 개의 우물 5 개, 200 μL에 0.1 % 젤라틴을 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양하고, 상판을 폐기한다. 플레이트를 37°C에서 다른 2시간 동안 배양한다.
3. 종자 HepG2-NE의 밀도에서 1 x 10⁴ 세포의 밀도2 우물 각각. 종자 293T-NE-3NRs 세포는 각각 2개의 우물에서 1 x 10⁴ 세포의 밀도(1 mmol/L 및 클로피브산에서 1mmol/L의 클로피브산에서 모든 트랜스 망토산을 배지에 첨가하여 RXRα 및 PPARα 핵 호르몬 수용체를 각각 활성화시켰다). 종자 293T-NE 1 x 10⁴ 세포의 밀도에서 잘 1.
   참고: 0.25% 트립신을 사용하여 서브 인플루엔자에 세포를 통과합니다. 셀 수를 계산한 다음 세포를 적절한 밀도로 시드합니다.
4. 세포를 37°C, 5%_CO2에서 24시간 동안 가습된 인큐베이터에서 배양하였다.
5. 표 3에서언급한 바와 같이 감염 복합체를 준비하고, HBV(HepG2.2.15 상피 농축), DMSO, PEG8000 및 감염 배지를 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브에 추가한다. DMSO에서 5mM의 농도로 용해하여 CsA 재고를 준비하고 주식을 -20 ºC로 유지하십시오. CsA의 작업 솔루션은 5 μM입니다. 48웰 플레이트의 웰당 1×10⁴ 셀을 시드합니다. HepG2.2.15 수퍼나탄 농축액(HBV 1.5063 ×10⁷ GEq/mL 포함)의 100 μL을 추가하여 150 GEq/셀에서 세포를 감염시보도록 합니다.
6. 각 웰에 감염 복합체의 500 μL을 추가하고 세포를 37°C, 24시간 동안 가습된 인큐베이터에서 5%_CO2로 배양한다.
7. 배지를 변경하기 전에 PBS의 500 μL로 셀을 두 번 세척합니다. 매질의 1mL를 각 웰에 넣습니다. 세포 상태가 좋지 않고 일부 세포가 떠있는 경우 배지를 직접 변경합니다. 이것은 감염의 날 1입니다. 2일마다 배지를 부드럽게 바꿉니다.
8. 11일, PBS 500 μL로 세포를 두 번 세척하고 면역형광을 위해 얼음 차가운 메탄올로 세포를 고정시한다.

6. HepG2.2.15 HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE와 공동 배양

1. 6 웰 플레이트의 5 우물에 0.1 % 젤라틴의 1 mL / 웰을 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양하고 상판을 폐기한다. 플레이트를 다시 37°C에서 2시간 동안 배양하여 우물을 완전히 건조시합니다.
2. 종자 1 x 10⁵ 세포/웰 HepG-NE의 2 개의 우물로, 293T-NE-3NRs에 2 우물, 그리고 293T-NE 플레이트의 1 우물에. 종자 1 x 10⁵ 셀/웰 의 HepG2.2.15 5 개의 멤브레인에 별도의 6 웰 플레이트에서 5 개의 멤브레인 (24mm, 0.4 μm 모공 직경, 코팅 되지 않은). 세포를 37°C, 5%_CO2에서 24시간 동안 가습된 인큐베이터에서 배양한다.
3. 24 시간 후에, 세포가 모두 응고되고 좋은 상태에서, 공동 배양을 준비하십시오. 6-잘 플레이트 및 세포막 인서츠에서 배지를 폐기하십시오. HepG2.2.15로 멤브레인 인서트를 HepG-NE, 293T-NE-3NRs 및 293T-NE 핀셋으로 시드된 6개의 웰 플레이트에 넣습니다. 가습인 인큐베이터에서 37°C, 5%_CO2에서 세포를 배양하고, 3-4일마다 배지를 변경한다.
   참고: 다음과 같이 그룹을 설정: 음 1: 293T-NE 공동 문화 HepG 와 2.2.15; 음 2: HepG2-NE 공동 배양 HepG 2.2.15; 웰 3: 293T-NE-3NRs HepG2.2.15와 공동 배양; 음 4: HepG 2.2.15 (CsA 추가)와 HepG2-NE 공동 문화; 웰 5: HepG2.2.15와 293T-NE-3NRs 공동 배양 (CsA 추가); 1번, 2, 3번까지 전체 배지를 추가하고, 5μM CsA를 가진 배지를 4번과 5에 잘 추가하고, 각 우물에 대해 약 9mL씩, 바이러스 입자가 트랜스웰에서 세포를 감염시키기 위해 접촉하는지 확인한다.
4. 10 일 후, 멤브레인을 제거하고, 6 잘 플레이트에 PBS를 추가하고 두 번 부드럽게 씻고, 면역 형광을 위해 얼음 차가운 메탄올로 세포를 고정하십시오.

7. HBcAg에 대한 면역 형광을 수행

1. -20°C에서 -20°C로 세포를 3시간 이상 폐기합니다. 셰이커의 실온에서 10분 동안 PBS로 셀을 씻고 3회 반복합니다.
2. BSA 5%(100 μL/48-잘 플레이트, 500 μL/6-잘 플레이트)를 추가하면 40rpm및 실온에서 1시간 동안 수평 셰이커를 흔들어 줍니다.
3. HBcAg 1차 항체 용액(1차 항체: 5% BSA 용액 =1:200, 100 μL/48웰 플레이트, 500 μL/6-잘 플레이트)를 4°C에서 하룻밤 동안 흔들어 줍니다.
4. PBST(PBS 0.1% 트위든 20)로 웰을 씻어내고, 셰이커의 실온에서 10분 동안 3회 반복합니다.
5. 두 번째 항체 용액(토끼 IgG에 대해 염소에서 들어올린 594개의 항체: PBS = 1:1,000, 100 μL/48웰 플레이트, 500 μL/6-잘 플레이트), 플레이트를 호일로 덮고 실온에서 2시간 동안 흔들어 줍니다.
6. PBST로 세 번 다시 씻고 10 분 동안 흔들십시오.
7. 1 μg/mL DAPI를 넣고 2분 동안 흔들어 주세요. PBST를 폐기합니다. PBS를 추가하고 면역 형광 현미경으로 관찰하십시오.

결과

우리는 NTCP 및 EGFP 융합을 표현하고 푸오마이신 저항을 표현하는 pSIN NTCP-EGFP 플라스미드를 건설했습니다. 플라스미드는 안정적인 세포주 HepG2-NE 및 NTCP 및 EGFP를 발현하는 293T-NE를 생성하기 위해 HepG2 및 293T 세포로 전염되었다. 푸오마이신 저항및 발현을 가진 플라스미드(pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-푸로 플래그)는 293T-NE 세포로 전환되어 4개의 숙주 유전자^9를발현하는 안정적인 세...

토론

여기서, 우리는 비간 293T-NE-3NR 및 hepatoma 기지를 둔 HepG2-NE 세포에 있는 HBV 감염을 위한 프로토콜을 소개합니다. 293T-NE-3NR은 높고 낮은 GEq 모두에서 HBV 감염에 적합했다. 프로토콜을 사용하는 동안 다음과 같은 중요한 단계를 고려해야 합니다. 세포 상태는 성공적인 감염을 위한 중요한 요인입니다. 감염 배지는 HBV 감염의 초기 기간 후에 적시에 변경되어야 합니다. 293T-NE-3NRs 세포는 일반적으로 높은...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45μm membrane filter	Millex-HV	SLHU033RB	Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate	BIOFIL	TCP010006	For co-culture
Amicon Ultra 15 ml	Millipore	UFC910008	For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA	Beyotime	ST023	For immunofluorescence assay
Cyclosporin A	Sangon biotech	59865-13-3	inhibitor of HBV infection
DAPI	Beyotime	C1006	For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)	DAAN GENE	7265-2013	For HBV DNA detection
DMEM	HyClong	SH30243.01	For culture medium
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS)	CLARK Bioscience	FB25015	For culture medium
Fluorescence microscope	ZEISS	Axio observer Z1	For immunofluorescence assay
HepG2-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
HBcAg antibody	ZSGB-BIO	ZA-0121	For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS	ZSGB-BIO	ZLI-9062	For cell wash
PEG8000	Merck	P8260	For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Thermo Fisher	10378016	For culture medium
Transwell	CORNING	3412	For co-culture
Tween 20	sigma-Aldrich	WXBB7485V	For PBST
Virkon	Douban	6971728840012	Viruside