분자 분석을 위한 소뇌 지역 해부

요약

다른 소뇌 영역은 뚜렷한 행동 출력에 있는 역할을 하기 위하여 연루되었습니다, 그러나 근본적인 분자 기계장치는 알려지지 않은 남아 있습니다. 이 작품은 RNA를 분리하고 유전자 발현의 차이를 테스트하여 분자 차이를 조사하기 위해 반구, 전방 및 후방 영역 및 깊은 소뇌 핵의 소뇌 피질을 재현하고 신속하게 해부하는 방법을 설명합니다.

초록

소뇌는 운동, 균형, 인식, 보상 및 영향을 제어하는 등 여러 가지 주요 기능에서 중요한 역할을합니다. 이미징 연구는 뚜렷한 소뇌 부위가 이러한 다른 기능에 기여한다는 것을 나타냅니다. 지역 소뇌 차이를 검사하는 분자 연구는 주로 전체 소뇌 추출물에서 수행되어 특정 소뇌 부위에 걸쳐 구별을 마스킹하기 때문에 뒤쳐지고 있습니다. 여기에서 우리는 4개의 다른 소뇌 지역: 깊은 소뇌 핵 (DCN), 전방 및 후방 버피소 피질, 그리고 반구의 소뇌 피질의 4개의 다른 소뇌 지구를 재보적으로 그리고 빨리 해부하는 기술을 기술합니다. 이러한 뚜렷한 영역을 해부하면 균형, 운동, 영향 및 인식에 대한 독특한 기여의 기초가 될 수 있는 분자 메커니즘의 탐사를 허용합니다. 이 기술은 또한 각종 마우스 질병 모형을 통해 이 특정 지역의 병리학 감수성에 있는 다름을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

서문

소뇌는 뇌의 뉴런의 절반 이상을 포함하고 역사적으로 뇌^1의모터 제어 및 균형 센터로 언급되었습니다. 최근에는 소뇌가 인지, 보상 처리,^2,3,4,5에영향을 미치는 등 다양한 기능에서 핵심적인 역할을 한다는 것을^{입증했습니다.}

소뇌는 잘 설명 된 해부학을 가지고 : 피질 영역은 과립, Purkinje, 및 분자 층으로 구성되어 있습니다. 과립 세포는 과립 세포 층을 형성하고 열등한 올리브에서 유래한 등반 섬유로부터 입력을 받는 분자 층의 Purkinje 세포 모순자로 병렬 섬유를 통해 입력을 보냅니다. Purkinje 세포는 소뇌에서 주요 출력역할을 깊은 소뇌 핵 (DCN)에서 세포에 억제 프로젝션을 보냅니다. 이러한 소뇌 회로의 출력은 골기, 스텔레이트 및 바구니^세포(4)를포함하는 소뇌 피질내의 억제 중뉴런의 활성에 의해 더 변조된다. 이 소뇌 기능 단위는 소뇌 피질의 모든 소구에 걸쳐 분포된다. 소뇌에 걸쳐이 상대적으로 균일 한 회....

프로토콜

1. 설정

1. 참수 가위, 무딘 집게, 해부 가위, 혈관 가위, 미세 한 미세 한 마우스 뇌 매트릭스, 면도날, 200 μL 파이프 팁, 유리 페트리 접시, 유리 슬라이드 및 얼음 양동이를 포함한 필요한 장비를 수집합니다. 흡수 패드에 모든 장비를 배치합니다.
2. 페트리 접시, 유리 접시, 뇌 매트릭스를 얼음 위에 놓습니다.
3. 수직 각도에서 면도날을 사용하여 200 μL 파이프 팁 의 끝에서 약 5mm를 다듬습니다. 이것은 팁의 끝에 있는 개구부 크기를 약 1mm 너비로 만듭니다. 이것은 DCN을 펀치하기에 충분해야합니다. 그러나 이것은 또한 해부에 따라 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 쉽게 교체하고 조정할 수 있는 많은 팁을 준비하십시오.
4. 동물 식별 및 소뇌 지역 (동물 당 4 개의 튜브)을 가진 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브를 라벨.
5. 냉동 안전 용기를 액체 질소로 채우고 추출 후 조직을 플래시합니다.

2. 뇌 추출 및 해부

모든 실험은 미네소타 대학의 동물 관리 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 5% CO_2....

결과

이러한 실험을 위해, 41주 된 암컷 야생형 C57/Black6 마우스가 사용되었다. 한 마우스는 '대량 소뇌'라고 불리는 전체 소뇌 해부를 실시하는 데 사용되었으며 해부 된 부위의 RNA 수준을 전체 해부에 비교할 수 있었습니다. 다른 3개의 마우스는 이 프로토콜에 기재된 소뇌 해부를 수행하기 위하여 이용되었다. 3개의 마우스를 사용하여 RNA의 수준에서 검출된 동향이 마우스를 통.......

토론

여기서 설명된 방법은 4개의 명백한 소뇌 지역 내의 근본적인 유전자 발현 및 분자 기계장치를 평가할 수 있게 합니다 - 깊은 소뇌 핵 (DCN), vermis의 전방 소뇌 피질 (CCaV), vermis의 후방 소뇌 피질 (CCpV), 및 반구의 소뇌 피질 (CCH). 이 지역을 별도로 평가하는 능력은 특정 소뇌 지역의 이질성에 대한 우리의 지식을 확장하고 다양한 행동에 대한 기여도를 밝힐 것입니다.

전체 뇌 조?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors