CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

요약

이 프로토콜은 형광 기자 및 세포 분류를 사용하여 대식세포 및 T 세포주에서 노크-인 실험을 단순화합니다. 2개의 플라스미드는 면역 세포에 있는 Rosa26 메뚜기에서 영구적으로 통합되는 EBFP2를 표현하는 EBFP2를 표현하는 상동성 재조합 기증자 플라스미드와 CRISPR/Cas9- 및 DsRed2 표현 플라스미드와 균등하게 재조합 기증자 플라스미드인 이러한 단순화된 노크-인 실험에 사용됩니다.

초록

면역 계통의 기능적인 유전체학 연구 결과는 표적 유전자의 삭제 및 관심있는 단백질에 요소의 추가를 둘 다 관련시키는 유전 조작을 요구합니다. 세포주 모형에 있는 유전자 기능의 확인은 세포 본질적인 기계장치의 유전자 발견 그리고 탐구를 위해 중요합니다. 그러나 CRISPR/Cas9 매개 노크인을 사용하여 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포의 유전자 조작은 특히 정지 상태에서 이러한 세포의 낮은 경질 효율 때문에 어렵습니다. 면역 세포에서 유전자를 수정하기 위해 약물 내성 선택 및 바이러스 벡터는 전형적으로 CRIPSR/Cas9 시스템을 발현하는 세포를 보강하는 데 사용되며, 이는 필연적으로 세포의 바람직하지 않은 개입을 초래합니다. 이전 연구에서는 전기기화 후 일시적으로 표현된 CRISPR/Cas9에 결합된 이중 형광 기자를 설계했습니다. 이 기술적인 해결책은 면역 세포에 있는 급속한 유전자 삭제로 이끌어 냅니다; 그러나, 약물 내성 선택 또는 바이러스 벡터를 사용하지 않고 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포에서 유전자 노크인은 더욱 도전적이다. 본 기사에서는, 당사는 세포 선별을 사용하여 기증자 플라스미드와 함께 Rosa26 궤적을 대상으로 CRISPR/Cas9 구조를 과도하게 표현하는 세포의 선택을 지원함으로써, 유전자 노크-인은 약물 저항 농축 없이 T 세포 및 대식세포 모두에서 달성될 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들어, 우리는 인간 ACE2를 발현하는 방법을 보여줍니다, SARS-Cov-2의 수용체, 이는 현재 Covid-19 전염병에 대한 책임이, RAW264.7 대식세포에서 노크 -인 실험을 수행하여. 이러한 유전자 노크 세포는 기계학 연구에 널리 사용될 수 있다.

서문

면역 세포는 병원체에 대한 방어를 위해 중요합니다. 선천성 면역은 감염제의 통관 및 조직 항상성^1,2의유지^보수에필요합니다. 세포주 모형은 포유류 면역 계통의 분자 기초를 이해하기 위한 필수적인 공구입니다; 그(것)들은 인간 T 세포 활성화를 모델링하는 것과 같은 체외 기능적인 소사에서 이용되고, 면역 반응^3,4를활성화하거나 감쇠에 있는 유전 요인의 기능을 결정하는 에서. 포유류 면역 계통은 엄청나게 이질적이며, 동등하게 중요한, 분자의 거대한 숫자는 주어진 세포^유형의분화, 이동 및 기능을 제어한다는 것을 주의하는 것이 중요합니다^5,6.

클러스터링 정기적으로 간격짧은 Palindromic 반복 (CRISPR)/Cas9 게놈 편집 도구는 정확한 방식으로 유전자의 기능성 기여를 용이하게 특정 세포 유형의 유전자 조작을 허용^7,8....

프로토콜

1. 로사26 로커스를 대상으로 sgRNAs의 설계 및 플라스미드 건설

1. 원하는 삽입 부위 주변의 설계 가이드 RNA
   1. 마우스 Rosa26(이하 mRosa26로 지정) 노크-인 실험에 대한 삽입 부위가 mRosa26의첫 번째 인트론에 위치하고 있는지 확인; 이 사이트는 이전 연구에서 사용 되었습니다^28,29. 인간 세포에서의 노크-인 실험의 경우, 삽입 부위가 mRosa26^30의인간 호모로로 확인된 인간 ROSA26 궤적(이하 hROSA26)에있는지 확인한다.
   2. 마우스 게놈 정보학(http://www.informatics.jax.org/)과 엔셈블 게놈 브라우저(http://www.ensembl.org/index.html)로부터 획득한 마우스 및 인간 종의 게놈 서열을 각각 사용한다. mRosa26 또는 hROSA26 궤적의 게놈 서열의 50개의 베이스 쌍(bp)을 복사하여 원하는 삽입 부위....

결과

murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 mRosa26 궤적에서 노크-인 실험을 수행하기 위해 전술한 프로토콜에 따라, SARS-Cov-2바이러스(도 2A)의수용체인 인간 ACE2를 발현하기 위한 표적 벡터를 설계하였다. 유사한 설계를 사용하여, 우리는 OST 태그 RASGRP1 융합 단백질(도 2C)의노크인인간 Jurkat T 세포를 생성했다. 3개의 플라스미드의 전환 후, 그 중 2개는 CRISPR/.......

토론

우리의 실험에서, 우리는 예를 예로 인간 Jurkat T 세포 및 murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 노크세포 검열 및 검증에 구조 설계에서 면역 세포에서 노크에 편집을 수행하는 방법을 보여주었습니다. T 세포및 대식세포주 모두 형질36,^37에내성이 있다; 그러나 CRISPR/Cas9 전달의 저효율 문제는 세포 분류와 결합된 형광 기자의 도움으로 극복할 수 있다. 이 프?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager 600	Ge Healthcare		imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt	MP Biomedicals	194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074	at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1	Merck	MABS146	1.0 μg/mL of working concentration
AscI	New England BioLabs	R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	8457	at 1/1000 dilution
BamHI-HF	New England BioLabs	R3136S
BbsI-HF	New England BioLabs	R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter	Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells	Takara	9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	MP Biomedicals	196055
DNeasy Blood & Tissue Kits	Qiagen	69506	cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose	HyClone	SH30022.01
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
FACSAria™ Fusion	BD Biosciences		equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube	BD Biosciences	352003
Fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	10099141
FlowJo version 10.7	BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	5174	at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	ThermoFisher Scientific	31430	at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane	Millipore	ISEQ00010
Jurkat	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate	MP Biomedicals	194531
LB agar powder	ThermoFisher Scientific	22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL)	Eppendorf, or similar
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix	New England BioLabs	(M0489)	for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	ThermoFisher Scientific	26616
Pipette tip 0.1-20µl	Eppendorf, or similar	0030 075.005
Pipette tip 2-200µl	Eppendorf, or similar	0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl	Eppendorf, or similar	0030 075.064
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
pX458-DsRed2	Addgene	112219
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England BioLabs	M0494S
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]	Abcam	ab108252	at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium	HyClone	SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads	IBA Lifesciences	2-1201-010
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	S34859
T4 DNA ligase	New England BioLabs	M0202S
T4 Polynucleotide Kinase	New England BioLabs	M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean	Eppendorf, or similar	0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning	3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates	Corning	3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate	Corning	3799