순환 종양 세포 주: 근본적이고 번역적인 연구를 위한 혁신적인 도구

요약

CtC를 배양하면 특정 마커 발현을 속이고 약물 내성과 다른 가능성 중 간을 식민지화하는 능력을 평가함으로써 암의 더 깊은 기능적 특성을 허용합니다. 전반적으로 CTC 문화는 환자 결과를 개선하기 위해 개인화 된 의학을위한 유망한 임상 도구가 될 수 있습니다.

초록

전이는 암 사망의 주요 원인입니다. 치료 전략의 개선에도 불구하고 전이성 암에는 예후가 좋지 않습니다. 따라서 우리는 전이 발달뒤에 기계장치를 이해하고, 이렇게 향상된 암을 위한 능률적인 처리를 제안하는 긴급한 필요에 직면합니다. 전이성 암은 생검이 침략적이고 접근할 수 없기 때문에 취급하기 어렵습니다. 최근에는 세포없는 순환 탈옥리보핵산(DNA) 및 말초 혈액으로부터 종양 세포를 순환하는 등 액체 생검에 상당한 관심이 있었으며, 전이성 대장암 환자로부터 여러 순환 종양 세포주를 확립하여 특성화에 참여하고 있다. 실제로, 기능적으로 이 희소하고 제대로 기술되지 않는 세포를 특성화하기 위하여, 중요한 단계는 그(것)들을 확장하는 것입니다. 일단 확립되면, 순환 종양 세포 (CTC) 라인은 그 때 현탁액 또는 응고 조건에서 배양될 수 있습니다. 분자 수준에서, CTC 라인은 면역 형광 또는 세포 측정 분석에 의해 관심의 특정 마커 (분화, 상피 또는 암 줄기 세포와 같은)의 발현을 평가하기 위해 더 사용될 수 있다. 또한 CTC 라인은 금 표준 화학 요법뿐만 아니라 표적 치료에 대한 약물 민감도를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. CTC 라인의 기능은 또한 면역 결핍 마우스에 있는 CTC의 피하 주입에 의해 시험될 수 있습니다.

마지막으로, 짧은 헤어핀 리보핵산(shRNA) 또는 Crispr/Cas9에 의해 CTC 유전자를 편집하여 암 보급에 관여할 수 있는 특정 유전자의 역할을 테스트할 수 있다. 따라서 변형된 CtC는 생체 내에서 전이성 개발 과정의 일부를 실험적으로 모방하기 위해 면역 결핍 마우스 비장으로 주입될 수 있다.

결론적으로, CTC 라인은 미래 연구와 개인화 된 의학을위한 귀중한 도구이며, 원래 전이를 담당하는 세포를 사용하여 치료 효율을 예측할 수 있습니다.

서문

최근 조기 암 진단및 치료 전략의 개선에도 불구하고 암 이환율의 90% 이상이 여전히 전이^1로인한 것입니다. 전이성 과정은 1차 종양으로부터 세포의 국소 분리로 시작하여 혈류로 들어가는 것으로 시작하여 순환종양 세포(CTC)가 되어 대장암(CRC)의 경우 간과 폐와 같은 먼 부위를 마지막으로식민지화한다. 최근에는 환자 혈액 샘플에서 CTC를 특히 감지하고 예중화하는 비침습적 도구인 액체 생검에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 종양 내 유전 적 이질성은 약물 내성의 주요 원인입니다. 따라서, 종양 물질로부터 대표 세포를 분리하는 것은 개인화된 약^3을위한 유망한 공구를 구성한다.

혈액내 CTC의 저주빈도에도 불구하고(106-10⁷ 백혈구당 1CTC)^4,CTC 및 혈액 ^5의다른 성분 간의 특성 차이에 기초하여 여러 가지 검출 및 격리 기술이 개발되었다. 환자 혈액 샘플에서 CTC의 수는 단독으로 악성, 치료 반응 및 질병 진행^6,7의단계에 대한 정보를 제공할 수 있다. 따라서, CTC 격리는 유전 이질성을 평가하거나 약물 스크리닝을 수행하는 번역 연구뿐만 아니라 전이성^유도8,9의주요 행위자로서 이러한 침습적 세포를 특성화하는 근본적인 연구를 위한 중요한 도구이다. 실제로, 시간이 지남에 따라 수천 개의 돌연변이를 축적한 상업적으로 확립된 암 세포주에 비해, 신선한 CTC는 전이할 수 있는 강력한 용량을 포함하여 원래 1차 종양의 주요 특징을 공유하고, 질병의 더 나은 반사이다. 이러한 기능은 특히 전이와 관련된 예측 된 주요 요인의 녹아웃 실험에서 기본 연구를위한 강력한 도구입니다. 이러한 실험의 결과는 아래에 설명된 바와 같이 마우스에 대한 생체 내에서검증될 수 있다.

일단 CTC가 고립되면, 그(것)들은 비 부착된 배양 조건에서 확장될 수 있고, 그(것)들은 어떤 유효한 암 세포주로 조작될 수 있고, 즉, 그(것)들은 과학적인 질문에 따라, 준수한 조건에서 동등하게 배양되거나 Matrigel에 내재될 수 있습니다^10. 예를 들어, 관심 있는 단백질의 발현 및 국소화를 테스트하기 위해 CTC 구체는 현탁 상태로 성장하고 히스토겔에 내장되어 구단 에 대한 면역형성을 수행할 수 있다. 또한, 단백질이 음골인 경우, 살아있는 세포에 대한 발현은 세포측정에 의해 측정될 수 있다.

기능적 연구를 위해, 간 식민지화에 역할을 할 수 있는 관심 있는 단백질의 역할을 시험하기 위하여는, shRNA 또는 CRISPR/Cas9에 의해 편집된 유전자를 가진 CTC는 면역 결핍 마우스의 비장에 주입될 수 있다. 이 후자의 실험은 간 전이 식민지^(11)를모방하는 강력한 모델이다.

CTC가 종양을 개시하는 기능은 면역 결핍 마우스로 세포의 아주 작은 수를 주입하여 평가될 수 있습니다. 종양 개시는 암 줄기 세포 (CSC)의 특징이기 때문에 이 분석은 CTC 라인 내의 CSCs의 비율을 나타냅니다. 이 줄기 세포 표현형은 몇몇 금 표준 암 치료에 저항하는 순환 종양 세포 주를 만듭니다. 따라서 확장된 CtC는 약물을 검사하고 환자를 위한 최상의 잠재적 효율적인 치료를 정확히 찾아내는 데 사용될 수 있습니다. 치료에 대한 CTC 반응은 발광 생존 가능성 분석, 예를 들어, 체외에서 테스트 할 수 있습니다.

장기적인 관점에서, 갓 고립되고 증폭된 CtC에 대한 약물 스크리닝은 환자를 위한 가장 효율적이고 적응된 치료를 선택하는 데 도움이 되는 개인화된 의학을 위한 새로운 도구로 사용될 수 있습니다.

본 논문에서, CTC 라인을 배양하는 프로토콜은 면역스테인링 및 세포측정을 통해 특정 단백질을 염색하고, CTC를 통한 생체 내 식이식 실험뿐만 아니라 세포 독성 분석도 수행한다.

프로토콜

모든 생체 내 프로토콜은 동물 윤리 기관에 의해 승인되었다.

1. 3D 문화 조건의 CTC 증폭

1. 서스펜션에서 CtC를 배양하기 위해, 5세포/μL의 최대 농도에서 초저부착(ULA) 24웰 플레이트의 우물에서 첫 번째 시드 CTC를 M12 배지의 1mL로 배양한다(즉,, 고급 DMEM-F12는 2mM l-글루타민, 100 단위/mL 페니실린 및 연쇄 절제술, N2 보충제, 20 ng/mL 표피 성장 인자 및 10 ng/mL 섬유아세포 성장 인자^10)로보충하였다.
2. 구 형성 및 세포 확장을 허용하려면 6~10일 사이에 저산소 조건(2% O_2)에서세포를 배양한다.
3. 구체가 충분히 크면 (100 μm) 괴사를 방지하기 위해 증폭을 위해 그들을 해리합니다.
   1. 셀 서스펜션을 2mL 튜브 또는 15mL 튜브및 원심분리기를 300 x g에 5분간 놓습니다.
   2. 상체를 제거하고 펠릿에 부드러운 해리 시약(예: Accumax)의 500 μL을 추가합니다.
   3. 소용돌이를 부드럽게 하고 37°C에서 20~30분 동안 부드러운 해리 시약으로 세포 현탁액을 배양합니다.
      참고: 부드러운 해리 시약(Accumax)에서 잠복기 시간을 초과하면 비정상적인 세포 사망률이 증가할 수 있습니다.
   4. 1.5mL의 인산염 완충식염수(PBS)를 넣고 300 x g에서 5분간 튜브원심분리기를 넣습니다.
   5. 상체를 부어 신선한 M12 배지에서 펠릿을 다시 떼어 내고 μL당 1-5 세포의 밀도에 도달합니다.
   6. 초저 부착 플레이트의 새로운 우물에서 셀 서스펜션을 시드: T75 플라스크용 10mL, 6개의 웰 플레이트용 2mL, 96개의 웰 플레이트용 100 μL

2. CTC 구 단면도에 염색하는 면역형광(IF)

1. 원심분리기 CTC는 300 x g에서 5분 동안 15mL 튜브로 구체하고, 수퍼네티드를 흡인시키고, PBS로 펠릿을 두 번 세척합니다.
2. 펠릿을 4% 파라포름데히드(PFA)의 500μL로 재차판하고 얼음 위에 20분 동안 배양합니다. 300 x g의 서스펜션을 원심 분리하고 PBS 5mL로 두 번 세척하십시오.
3. 펠릿을 (즉, 15 ~ 20 μL)로 재연하십시오(예: 15~20 μL) 뜨겁고 액체 히스토겔. 파이펫으로 모든 서스펜션을 가지고 4 °C에서 미리 냉각 된 표면에 액적을 만들고 5 ~ 10 분 동안 중합할 수 있습니다.
   참고: 팁에 서스펜션의 중합화를 피하기 위해 빠르게 작업하십시오.
4. 메스 블레이드로 고체 액자를 분리하고 구획 된 포함 카세트에 삽입합니다.
5. 파라핀 포함, 파라핀 절제, 절개 재수화, 항원 검색 및 항체 배양: 다음 단계를 수행한다. 이러한 단계는 파라핀에 내장된 종양 또는 장기와 동일하며 면역형광^{염색(12)을}위해 처리된다.
   참고: 카세트는 파라핀이 내장될 때까지 4°C에서 70% 에탄올로 보관할 수 있습니다.

3. 세포분석

1. 원심분리기 CTC는 300 x g에서 15mL 튜브로 5분 동안 구체를 넣고 PBS로 펠릿을 두 번 세척합니다.
2. 상류체를 흡인하고 부드러운 해리 시약의 500 μL을 펠릿에 추가합니다.
3. 소용돌이는 37°C에서 20 내지 30분 동안 부드러운 해리 시약으로 셀 서스펜션을 부드럽게 배양한다.
   참고: 부드러운 해리 시약(Accumax)에서 40분 이상의 배양을 초과하면 비정상적인 세포 사망률이 발생할 수 있습니다.
4. 300 x g에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하고, 상류체를 제거하고 블로킹 버퍼 (즉, 1 % 소 세럼 알부민 (BSA)의 5 mL에서 펠릿을 재연한다.
5. 40 μm 셀 스트레이너를 통해 셀 서스펜션을 통과하여 나머지 구체를 제거합니다.
6. 계산 후, 3개의 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 튜브에 200,000 세포를 넣고, 원심분리기는 300 x g에서 5 분 동안 300 x g로 넣고 상신수를 제거합니다. 스테인링 시약을 받지 못하는 세 가지 FACS 튜브 중 하나를 컨트롤로 사용하십시오.
7. 데이터 시트에 따르면, 나머지 두 개의 FACS 튜브에 적절한 항체를 추가합니다(즉, 관심 있는 단백질에 대하여 공주항체 1개, 컨쥬게이드 동형 대조군).
8. 권장 인큐베이션 시간 후, 차단 버퍼의 300 μL을 추가하여 세포를 세척하고 300 x g의 3 개의 튜브를 원심 분리하고 슈퍼 나티부를 흡인합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 그런 다음, 세포 생존 성 염색 시약으로 차단 버퍼로 펠릿을 다시 중단하십시오 (염색없이 FACS 튜브 제어를 제외하고).
9. FACS 분석될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 먼저 튜브를 염색하지 않고 사용하여 세포 생존가능성 및 항체 염색을 위한 게이트를 식별합니다. 그런 다음 관심있는 단백질에 대해 공액 항체로 FACS 튜브를 분석하여 관심있는 단백질을 표현하는 CTC의 비율을 정량화합니다. 컨쥬게이드 동종형 컨트롤이 있는 FACS 튜브는 시프트를 나타내서는 안 됩니다. 이것은 교대가 관심의 표적 단백질에 특정하다는 것을 확인합니다.
   참고: 가능하면, 단백질을 음의 대조군으로 표현하지 않는 양성 조절 및 세포주로서 높은 수준의 관심 단백질을 표현하는 세포주를 사용한다.

4. 발광 생존 가능성 분석 (셀티터 글로)

1. M12 배지에서 해리된 CtC(섹션 1.4.5에 설명된 대로)를 다시 일시 중단합니다. 세포를 계산하고 세포 농도를 200,000 세포/mL로 조정합니다.
2. ULA 96 웰 플레이트에서, 종자 10,000 잘 당 해리 CTC, 50 μL, 24 시간 동안 저산소증 (2% O_2)에서플레이트를 배양.
3. 다음 날, CtC에 테스트 된 약물의 50 μL을 추가합니다. 그것은 이전에 절반 최대 억제 농도 를 결정 하기 위해 약물 농도의 적정을 수행 하는 것이 좋습니다 (IC50). 기저 세포 생존 가능성을 결정하기 위해 차량으로 일부 우물을 치료하십시오.
   참고: 시드된 셀수는 두 배의 시간에 따라 CTC 선 간에 다를 수 있습니다. 또한 셀은 결과 가변성을 최소화하기 위해 삼중으로 시드되어야 합니다.
4. 또 다른 48 시간 저산소증에 플레이트를 배양.
5. 3일째에, 제조업체 프로토콜에 따라 배양된 플레이트와 발광 세포 생존력 버퍼 및 기판을 실온에 배치하고 적절한 버퍼로 기판을 재구성한다.
6. 각 배양 된 접시에 발광 생존력 혼합의 70 μL을 추가합니다. 20분 동안 궤도 셰이커에 플레이트를 올려 세포 용액을 유도한 다음 윤미계와 호환되는 불투명벽 멀티웰 플레이트에 믹스의 100 μL을 전달합니다.
7. 플레이트가 실온에서 휴식을 취하도록 허용하고, 발광 신호를 안정화하기 위해 알루미늄 호일로 덮습니다.
   참고: 발광 신호는 최대 3시간 동안 안정적입니다.
8. 마이크로 플레이트 판독기(예: 테칸 인피니트 200 Pro)를 사용하여 발광을 기록합니다.
9. 데이터 분석을 위해 조건당 삼중 반사 상대 광 단위 RLU의 평균을 계산합니다. 필요한 각 약물 농도에 따라 생존력의 비율을 평가하기 위해: (치료되지 않은 세포의 치료 된 세포 /RLU의 RLU) x 100.

5. 피하 주사

1. 마이크로원심분리기 튜브에서 멸균 PBS의 100 μL에서 세포를 재중단합니다. 주입된 세포의 수가 낮은 경우에, 1:1 PBS/Matrigel에 있는 세포를, 성장 인자에서 감소하는, 함께 세포를 집중하고 종양 개시를 승진시키기 위하여.
   참고: 세포 밀도는 10세포(종양 개시 능력에 도전하기 위해)에서 과학적 질문및 실험의 목표에 따라 100만 개의 세포로 할 수 있다.
2. 인슐린 주사기의 전체 볼륨을 당깁니다.
3. 면역 결핍 마우스에, 인덱스와 반지 손가락 사이의 측면의 피부를 꼬집어 부드럽게 피부의 바닥에 바늘을 삽입.
   참고 : 이 절차는 고통스럽지 않으며 의식이있는 마우스에서 수행됩니다.
4. 세포의 확산을 방지하기 위해 천천히 같은 자리에 볼륨을 주입. 이것은 피부 아래에 작은 출혈을 만들 것입니다.
5. 볼륨의 역류를 방지하기 위해 사출 부위에 부드러운 압력을 가하십시오.
6. 캘리퍼를 사용하여 매일 종양 성장을 모니터링하십시오.
7. 종양이 1500 mm^3을초과하는 경우 동물을 희생하십시오. 재료 가용성에 따라, 이산화탄소 또는 마취 가스 흡입 또는 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사.

6. 내장 주입

1. 시작하기 전에 수술 기구 (가위 및 집게)를 124 °C에서 15 분 동안 자동 복제하고 70 %의 에탄올로 작업 공간의 모든 표면을 청소하십시오.
2. 마이크로원심분리기 튜브에서 멸균 PBS의 50 μL에서 세포를 재중단하고 얼음에 보관하십시오. 세포 밀도는 0.5에서 1백만 세포로 갈 수 있습니다. 세포의 더 많은 수는 혈액 순환으로 혈전 발달을 일으킬 수 있습니다.
3. 세포를 주입하기 전에 통증 완화를 위해 0.015 mg/mL buprenorphine의 100 μL을 피하로 주입하십시오.
4. 마우스를 유도 챔버에 놓아, 여기서 이소플루란은 3 %로 유지되고, 2-3 분. 동물이 더 이상 움직임에 반응하지 않는 경우, 가열 패드에 오른쪽에 넣어 O_2와 이소플루란의 가스 혼합물을 제공하는 호흡 회로 얼굴 마스크를 사용하여 마취를 유지합니다.
5. 수술 중 눈 건조를 피하기 위해 각 눈 위에 눈 윤활유를 바르십시오. 포비도요오드 용액(예: 베타딘)으로 흉부 부위를 소독합니다.
6. 등소벤트 측에서는 10번째 거짓 갈비 아래가위를 사용하여 0.5cm의 작은 절개를 합니다.
7. 비장을 부드럽게 들어 올리고 멸균 거즈위에 놓습니다. 인슐린 주사기를 사용하여 비장 끝에 CTC50 μL을 주입하십시오. 주사기를 똑바로 유지하고 역류를 피하기 위해 3-5 분 기다린 다음 바늘을 제거하십시오.
8. 양면(동맥과 정맥)에서 비장 혈관을 리게이트하고 두 합자 바로 위에 절단하여 비장을 제거합니다. 비장이 기관에서 원치 않는 종양 형성을 방지하기 위해 제거됩니다.
9. 5.0 분해 성 멸균 봉합사를 사용하여 복부 복막과 피부를 스티치하십시오.
10. 마취에서 완전히 회복 될 때까지 마우스를 따뜻하게 유지하십시오.
11. 비정상적인 신체 기능, 비정상적인 운동 및 자세 및 체중 감량을 위해 일주일에 3 일 동안 마우스를 모니터링하십시오.
12. 인간적인 끝점이 도달할 때 동물을 희생하십시오 (수술 후 약 6 주) 간 전이를 분석하십시오.

결과

IF(도 1A 오른쪽 패널)와FACS(도1B)에의해 각각 관찰된 EpCAM 및 CD26 식은 각각 CTC 라인이 상피임을 나타내고 CSC 특징¹⁰중 하나를 표시함을 나타낸다. 이 상피 특성은 다른 상피 및 중간 엽 마커에 대한 항체로 염색함으로써 더욱 특징지을 수 있습니다. 따라서 CTC 선이 상피-중간엽 축을 따라 어디에 있는지 대략 알 수 있을 수 있...

토론

전술한 프로토콜은 처음에 대장 CTC 기능특성화를 위해 사용되었지만 유방암과 같은 다른 유형의 암에 사용될 수 있으며 마우스 모델에 적응할 수 있다.

실제 제한 요소는 혈액 샘플에 존재하는 CtC의 수와 이를 분리하고 확장하는 데 사용되는 기술의 효율성입니다. 몇몇 CTC 격리 기술자들은 세포 크기 및 그것의^{압축성(13)에}근거하여 CTC의 격리를 허용하는 파s...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax solution	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070063