Pure Shift 핵 자기 공명: 식물 대사체학을 위한 새로운 도구

요약

이 논문은 식물의 대사 프로파일링에서 PSYCHE 및 SAPPHIRE-PSYCHE의 사용을 제시하고 샘플 준비 및 최적의 Pure Shift NMR 스펙트럼 기록에 대한 자세한 절차를 포함합니다. 동핵 디커플링에 의해 달성된 분해능의 이득을 통해 시스템을 보다 포괄적으로 이해할 수 있는 예가 논의됩니다.

초록

핵 자기 공명(NMR)은 대사체학에 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나입니다. 이는 정량적 데이터를 제공할 뿐만 아니라 복잡한 혼합물에 존재하는 대사 산물의 구조적 식별을 가능하게 하는 매우 정확하고 재현 가능한 방법입니다.

¹H NMR에 의한 대사 프로파일링은 작물 상태 평가, 수확 및 수확 후 처리, 대사 표현형, 대사 경로, 유전자 조절, 바이오마커 식별, 화학 분류학, 품질 관리, 원산지 명칭 등을 포함하는 다양한 유형의 식물 시나리오 연구에 유용한 것으로 입증되었습니다. 그러나 확장된 J-커플링 다플리티와 함께 많은 수의 공진의 신호 중첩은 스펙트럼 분석 및 해석을 복잡하게 만들고 고전적인 ^1HNMR 프로파일링에 대한 한계를 나타냅니다.

지난 10년 동안 다중 신호가 단일 공진선으로 붕괴되는 새로운 NMR 광대역 동핵 디커플링 기술(일반적으로 순수 시프트 방법이라고 함)이 ^1HNMR 클래식 스펙트럼에 내재된 스펙트럼 해상도 문제를 극복하기 위해 개발되었습니다.

여기에서는 식물 추출물 준비의 단계별 프로토콜과 바닐라 식물 잎, 감자 괴경(S. tuberosum) 및 케이프 구스베리(P. peruviana)의 세 가지 다른 식물 매트릭스에서 최적의 Pure Shift PSYCHE 및 SAPPHIRE-PSYCHE 스펙트럼을 기록하는 절차를 제시합니다. 대사 식별, 상관 관계 분석 및 다변량 분석에서 분해능 증가의 효과는 고전적 스펙트럼과 비교하여 논의됩니다.

서문

유기체를 구성하는 완전한 대사 산물 세트(생물학적 과정의 기질, 중간체 및 최종 산물)는 1998년에 대사체(metabolome)라는 용어와 함께 만들어졌습니다. 대사체가 표현형과 밀접한 관련이 있다는 것은 잘 알려져 있으며, 유전자형과 환경 사이의 직접적인 상호 작용을 반영하기 때문에 식물에 특히 관심이 있습니다 ^1,2. 따라서 대사체 프로필의 특성화는 식물에서 가장 중요한 요소가 되었습니다. 바이오마커(주요 대사 산물) 및 대사 패턴의 식별 및 정량화를 통해 종, 품종, 발달 단계, 병원성 질병 또는 환경 조건(일일 및 계절 변화, 토양, 수분 스트레스, 기계적 스트레스, 수확 및 수확 후 처리) 간의 구별이 가능해졌습니다 ^3,4,5.

질량 분석법(MS) 및 핵 자기 공명(NMR) 분광법은 이러한 목적을 위해 가장 널리 사용되는 분석 플랫폼입니다. MS 방법론과 달리 NMR은 재현성이 높고, 편향되지 않고, 정....

프로토콜

1. 시료 전처리

1. 케이프 구스베리
   1. 100-200g의 신선한 과일을 블렌더 꽃병에 넣습니다. 4°C에서 30분 동안 유지한 다음 실험실 블렌더에서 균질화합니다.
   2. 즉시 주스를 50mL 플라스틱 튜브에 옮기고 액체 질소에 얼린 다음 4-5 일 동안 건조시킵니다.
   3. 전기 그라인더를 사용하여 동결 건조 된 재료를 미세한 분말로 분쇄합니다.
      알림: 분말은 흡습성이 높기 때문에 건조 물질의 취급을 신속하게 수행해야 합니다.
   4. 분쇄 재료 1g의 무게를 측정하고 초순수 10mL를 추가합니다. 1분 동안 소용돌이
   5. 10 ° C에서 20 분 동안 초음파 처리 한 다음 23,000 × g 에서 10 ° C에서 20 분 동안 원심 분리합니다.
   6. 상층액을 회수하고 13mm 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 0.45μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
   7. 여과된 추출물 1mL를 동결건조시킨 후 얻어진 고체를 0.9mL의 200mM 옥살산나트륨 완충액 pH 4에 다시 현탁시킵니다. 소용돌이.
   8. 생성된 샘플을 동결건조시켜 건조시키고 5mM의 3-(트리메틸실릴)프로피온-2,2,3,....

결과

NMR 스펙트럼 분석
PSYCHE 실험은 결합된 공명을 단일항²¹로 축소하여 스펙트럼 분해능을 증가시키며, 이는 차례로 중복을 줄이고 할당 및 데이터 분석을 용이하게 합니다. Pure Shift NMR은 식물 추출물에 적용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 바닐라 잎, 감자 괴경 및 Physalis peruviana 과일의 세 가지 다른 매트릭스에서 그 사용을 보여줍니?.......

토론

대사체 구조 식별 및 정량화는 대사체의 특성화에서 핵심 문제이며, 다변수 분석을 통해 연구 중인 생물학적 시스템을 더 잘 이해할 수 있는 데이터입니다. 시료 전처리 및 데이터 수집은 신뢰할 수 있는 결과를 제공하기 위해 최적화가 필요한 중요한 측면입니다.

이 기사에서는 세 가지 다른 식물 매트릭스의 NMR 분석을 위한 샘플 준비를 설명하고 설.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
77500 Series Freezone 4.5 Liter benchtop	Labconco	77500
Bruker Avance III 500 MHz equiped with a 5 mm TCI Z-gradient cryogenic probe	Bruker Corporation
Centrivap Refrigerated Centrifugal Concentrators Labconco 7310000 Series	Labconco	7310000
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882
Grinder machine MKM6003	Bosch	MKM6003
Licuadora Blender 8011S model Hgb2wts3	Waring	Hgb2wts3
Methanol-d4	Sigma-Aldrich	151947