미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성

요약

우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.

초록

미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타내며 현재 불치입니다. 이 질병은 그 근본적인 기계장치가 해명될 남아 있는 신경 발달 결함을 일으키는 원인이 됩니다. 주요 장애물은 환자에서 볼 수있는 초기 발병 신경 장애를 재구성 하는 효과적인 모델의 부족. 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)의 기술의 발전은 신경계의 발달 및 조직에 대한 질병의 영향을 조사하는 데 사용될 수 있는 3차원(3D) 뇌 오르가노이드의 생성을 가능하게 한다. 연구원은, 이 저자를 포함하여, 최근에 미토콘드리아 무질서를 모형하기 위하여 인간 적인 두뇌 오르가노이드를 소개했습니다. 이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 견고한 생성과 미토콘드리아 생물 학적 프로파일링 및 이미징 분석에서의 사용에 대한 상세한 프로토콜을보고합니다. 이 실험은 신진 대사 및 발달 기능 장애를 조사하기 위하여 두뇌 organoids의 사용을 허용할 것입니다 미토콘드리아 질병의 신경 병리를 해부하기 위하여 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

서문

미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스^{를 나타냅니다1}. 그(것)들은 산화 인산화 (OXPHOS)², 호흡 사슬 조립, 미토콘드리아 역학 및 미토콘드리아 DNA 전사 또는 복제를 포함하여 다른 미토콘드리아 프로세스를 방해하는 유전 돌연변이에 기인합니다 ³. 에너지 요구 사항이있는 조직은 특히 미토콘드리아 기능 장애⁴에 의해 영향을받습니다. 따라서 미토콘드리아 질환을 가진 환자는 일반적으로 조기 발병 신경 학적 증상을 개발합니다.

미토콘드리아 질환에 걸린 어린이에게는 현재 치료법이 없습니다⁵. 미토콘드리아 질환의 약물 개발을 위한 주요 장애물은 인간 질병 과정을 재구성하는 효과적인 모형의 부족^입니다6. 현재 연구된 동물 모델 중 일부는 환자에서 존재하는 신경학적 결함을 나타내지 않는다⁷. 따라서 미토콘드리아 질환의 신경 병리학의 기본 메커니즘은 여전히 완전히 이해되지 않습니다.

최....

프로토콜

참고: 인간 ipC를 사용하려면 윤리적 승인이 필요할 수 있습니다. 이 연구에서 사용된 iPSC는 지역 윤리 승인(#2019-681)에 따라 건강한 대조군 개인에게서 파생되었습니다. 모든 세포 배양 절차는 멸균 세포 배양 후드하에서 수행되어야하며, 후드 아래에 옮기기 전에 모든 시약과 소모품을 신중하게 소독해야합니다. 분화에 사용되는 인간 iPSC는 광범위한 문화권에서 발생할 수 있는 잠재적인 게놈 수차를 피하기 위해 50 이하의 통로 번호를 가져야 합니다. 세포의 다능성 상태는 예를 들어 NANOG 또는 OCT4와 같은 자발성 관련 마커의 발현을 모니터링함으로써 오르가노이드 생성 전에 검증되어야 한다. 마이코플라즈마 테스트는 마이코플라즈마 없는 배양을 보장하기 위해 매주 실시되어야 합니다.

1. 뇌 오르가노이드의 세대

1. 인간 iPSC의 문화
   1. iPSC 배지에서 피더없는 조건하에서 배양 인간 iPSCs ( 재료의 표 참조) 코팅 된 6 웰 플레이트에 및 37 ° C 및 5 % _CO2에서 가습 된 조직 배양 배양 배양에 보관하십시오.
      참고: 피더 세포의 이월은 오르가노이드 분화를 방해할 수 있습니다. 피더가 없는 조건에서 적어도 한 번 은 세포를 통과합니다.

결과

여기에 설명된 프로토콜은 둥근 오르가노이드의 견고한 생성을 용이하게 한다 (그림 1A). 생성된 오르가노이드는 축산(SMI312) 및 원원수(microtubule-관련 단백질 2(MAP2)에 특이적인 단백질 마커를 사용하여 시각화될 수 있는 성숙한 뉴런 (도 1B)을 함유하고 있다. 성숙한 오르가노이드는 뉴런 세포(MAP2 양성) 뿐만 아니라 .......

토론

이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 재현 가능한 생성과 미토콘드리아 질환 모델링에 대한 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 이전에 게시된 ^work20에 따라 수정됩니다. 본 프로토콜의 한 가지 주요 장점은 각 오르가노이드의 수동 포함을 비계 매트릭스에 포함시키지 않는다는 것입니다. 실제로, 매트릭스 용액은 단순히 세포 배양 배지에 용해된다. 더욱이, 고.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010
Affinity Designer	Serif (Europe) Ltd		Layout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig	Sigma Aldrich	SAB4600033-250UL	1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-31571	1:300
Antimycin A	Sigma Aldrich	1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)	Sigma Aldrich	T8578	1:2000
Argon Laser	Melles Griot		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acid	Sigma	A92902
B-27 with Vitamin A	Gibco	17504044
Bacto Agar	Becton Dickinson		3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNF	Miltenyi Biotec	130-093-0811
cAMP	Sigma	D0627
Cell Star cell culture 6 well plate	Greiner-Bio-One	657160
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031
Confocal laser scanning microscope C1	Nikon Microscope Solutions		Modular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231	Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher	C7026
DMEM/F12	ThermoFisher	31330038
DMSO	Sigma	D2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3	Merck Millipore	AP180C	1:300
Donkey anti-mouse Cy3	Merck Millipore	AP192C	1:300
Donkey anti-rabbit Cy3	Merck Millipore	AP182C	1:300
DPBS	Gibco	14190250
DS-Q1Mc camera	Nikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91	Nikon Microscope Solutions		Imaging software for confocal microscope
FCCP	Sigma Aldrich	370-86-5
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-291
Glasgow MEM	Gibco	11710-035
Glass Pasteur pipette	Brand	747715	Inverted
Glutamax	Gibco	35050-061
Helium-Neon Laser	Melles Griot		Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
Heparin	Merck	H3149-25KU
HERACell 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	1:2500
Image J 1.53c	Wayne Rasband National Institute of Health		Image processing Software
Injekt Solo 10 mL/ Luer	Braun	4606108V
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828010
Laser (407 nm)	Coherent		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2	Synaptic Systems	No. 188004	1:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAA	Gibco	11140-050
mTeSR Plus	Stemcell Technology	85850	iPSC medium
Multifuge X3R Centrifuge	Thermo Scientific	10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	# LT07-218
N2 Supplement	Gibco	17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW)	Neoject	10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2	Nikon		Imaging software
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
PAP Pen	Sigma	Z377821-1EA	To draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kit	Worthington	LK003150
Paraformaldehyde	Merck	818715	4% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mL	VWR	612-1681	Graduated up to 3 mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0	Nikon Microscope Solutions		Dry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13	Nikon Microscope Solutions		Oil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm)	Greiner Bio-One	664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)	Falcon	352235
Potassium chloride	Roth	6781.1
ProLong Glass Antifade Moutant	Invitrogen	P36980
Qualitative filter paper	VWR	516-0813
Rock Inhibitior	Merck	SCM075
Rotenone	Sigma	83-794
S100β	Abcam	Ab11178	1:600
SB-431542	Cayman Chemical Company	13031
Scalpel blades	Heinz Herenz Hamburq	1110918
SMI312	Biolegend	837904	1:500
Sodium bicarbonate	Merck/Sigma	31437-1kg-M
Sodium chloride	Roth	3957
Sodium dihydrogen phosphate	Applichem	131965
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
SOX2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-17320	1:100
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco/StemPro	A1110501	Reagent A
Super Glue Gel	UHU	63261	adhesive gel
SuperFrost Plus	VWR	631-0108
Syringe for single usage (1 mL)	BD Plastipak	300015
TB2 Thermoblock	Biometra
TC Plate 24 Well	Sarstedt	83.3922
TC Plate 6 Well	Sarstedt	83.392
TGFbeta3	Miltenyi Biotec	130-094-007
Tissue Culture Hood	ThermoFisher	51032711
TOM20	Santa Cruz Biotechnology	SC-11415	1:200
Triton-X	Merck	X100-5ML
UltraPure 0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
Vibratome Microm HM 650 V	Thermo Scientific		Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.
Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade	Wilkinson Sword	70517470
Whatman Benchkote	Merck/Sigma	28418852
Wnt Antagonist I	EMD Millipore Corp	3378738
XF 96 extracellular flux analyser	Seahorse Bioscience	100737-101
XF Assay DMEM Medium	Seahorse Bioscience	103680-100
XF Calibrant Solution	Seahorse Bioscience	100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate)	Seahorse Bioscience	102416-100