제노푸스 라레비스 배아의 블라스코클로로 분비된 성장 인자 변형 분석 가족 분열 제품

요약

성장 인자 ß 를 변형할 때 가족 전구체 단백질은 제노푸스 라예비스 배아에서 ectopically 발현될 때, 그들은 분화하고, 갈라지고, 초기 가스트루라 단계로 늦은 블라술라에서 시작되는 blastocoele로 분비됩니다. 우리는 면역 blot 분석을 위한 blastocoele 캐비티에서 분열 제품을 심는 방법을 설명합니다.

초록

Tgfß/Nodal 또는 뼈 형태유전학 단백질(Bmp) 리간드로 표현되는 변형 성장 인자 ß(Tgfß) 슈퍼 패밀리의 두 팔은 배아 발달과 성인 항상성에서 필수적인 역할을 합니다. Tgfß 가족의 구성원은 내시경 망상 내에서 이산화 하고 접는 비활성 전구체로 만들어집니다. 전구체는 이어서 리간드 및 프로도메인 조각으로 갈라진다. 비록 디메라 리간드만 Tgfß 수용체를 참여시키고 다운스트림 신호링을 활성화할 수 있지만, 프로도메인 모이티가 리간드 활동에 기여한다는 인식이 증가하고 있습니다. 이 문서에서는 Tgfß 전구체 단백질의 활성화 중에 생성된 분열 제품을 식별하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. Tgfß 전구체를 코딩하는 RNA는 X. laevis 배아로 처음으로 마이크로 주입됩니다. 다음 날, 분열 제품은 가스트룰라 단계 배아의 blastocoele에서 수집되고 서양 얼룩에서 분석됩니다. 이 프로토콜은 비교적 빨리 완료 될 수 있으며 고가의 시약을 필요로하지 않으며 생리적 조건하에서 농축 된 Tgfß 분열 제품의 원천을 제공합니다.

서문

변형 성장 인자 ß (Tgfß) 슈퍼 패밀리의 구성원은 비활성, 이질 전구체 단백질로 합성된다. 전구체는 그 때 분비 통로 내 또는 세포의 외부proprotein 변환기 (PC) 가족의 일원에 의해 갈라지는 것입니다. 이렇게 하면 활성 이황화물 결합 리간드 디머와 두 개의 프로도메인 조각^1이생성됩니다. 30년 이상 알려져 왔지만 Tgfß 가족 전구체의 프로도메인이 활성 리간드^2를생성하는 데 필요하며, 프로도메인이 리간드 기능에 어떻게 기여하는지에 대한 이해는 불완전합니다.

Tgfß 가족 구성원의 프로테오리틱 활성화 과정에 대한 이해는 불완전하지만, 특정 세포 외 또는 세포 외 구획에서분열이 발생하는지 여부, 그리고 프로 도메인이 크리브 리간드^3와공유 또는 비일관성으로 연관되어 있는지 여부에 대한 이해에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 여러 연구는 프로 도메인이 분열^4,5전에 리간드 접이식을 안내 할뿐만 아니라, 또한 성장 인자 안정성과 작용의 범위에 영향을 미칠 수 있음을 보여 주었다^6,....

프로토콜

설명된 모든 절차는 유타 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받습니다. 개구리는 IACUC 승인 시설에 보관됩니다. 수컷 개구리는 심장의 심실을 클리핑하여 트리카인에 침수하여 안락사됩니다. 암컷 개구리는 달걀 수집을 허용하기 위해 산란의 호르몬 유도다음 최대 24 시간 동안 실험실에 보관된 다음 치료 시설로 돌아갑니다.

1. X. laevis 고의 컬렉션

1. 동물이 발톱 핀치에 반응하지 않을 때까지 30-40 분 동안 0.2 % 트리카인(표 1)에서성적으로 성숙한 남성을 마취합니다.
2. 무딘 집게를 사용하여 피부가 바디 월에서 멀리 당겨. 수술 가위를 사용하여 하복부를 가로 질러 피부에 수평 절개를합니다. 기본 바디 월에서 평행 절개를 한 다음, 흉곽을 통해 바디 벽을 통해 세 번째 수직 절개를 합니다.
   1. 결과 플랩을 다시 접어 심장의 심실을 찾아 서 발굴 하 고 죽음을 보장 하기 위해 기지를 잘라.
3. 무딘 집게로 복부에서 노란 지방 시체를 당기고 각 면의 고환을 찾아 지방 몸의 기본을 찾습니다. 각 고환을 제거 하 여 지방 몸 과 수술 가위를 사용 하 여 부착 된 내장에서 멀리 클리핑 하....

결과

아래에 설명된 실험의 목표는 Bmp4와 Bmp7 형태 이성구(Bmp4 리간드 1개와 Bmp7 리간드 1개로 구성된 디머), 호모디머(Bmp4 또는 2개의 Bmp7 리간드로 구성됨) 또는 X. laevis에서 공동 발현될 때 각각의 혼합물을 결정하는 것이었습니다. 도 2에 표시된 데이터는 이전에 게시된 연구^10에서추출된다. 도 2A는 Bmp4 또는 Bmp7 균질 전구체 또는 Bmp4/.......

토론

여기에 설명된 프로토콜의 주요 장점은 비교적 빨리 완료될 수 있고, 고가의 시약을 필요로 하지 않으며, 생리학적 조건 하에서 농축 된 Tgfß 분열 제품의 원천을 제공한다는 것이다. 또 다른 장점은 에피토프 태그 단백질을 분석하고 따라서 대부분의 Tgfß 가족 prodomain을 인식하는 상업적으로 이용 가능한 항체의 부족을 우회할 수 있다는 것입니다. 또한 전감염된 배양 포유류 세포에서 에피토프 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ß-mercaptoethanol	Fisher	AC125470100
Bromophenol Blue	Fisher	B392-5
Calcium Chloride	Fisher	C79-500
Calcium Nitrate	Fisher	C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder	Fisher	12-141-364
Dumont #5 forceps	Fine Science tools	11251-10
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150H
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm	Narshige	G-1
Glycerol	Fisher	G33-4
HEPES	Fisher	BP310-500
Human chorionic gonadotropin	Sigma Aldrich	CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL	Fisher	8881501368
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
Magnesium Sulfate	Fisher	M63-500
Needle, 26 G	Fisher	305111
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140148
Picoliter Microinjector	Warner Instruments	PLI-100A
Pipette Puller	Narashige	PC-100
Potassium Chloride	Fisher	P217-500
PVDF Membrane	Sigma Aldrich	IPVH00010
Sodium Bicarbonate	Fisher	S233-500
Sodium Chloride	Fisher	S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher	BP166-500
Sodium Hydroxide	Fisher	S318-500
Tricaine-S	Pentair	TRS5
Tris	Fisher	BP152-5