자가형광을 이용한 Neural Stem Cell Activation State In Vitro 분류

요약

이 프로토콜은 i) 컨포칼 현미경, ii) 강도 이미징을 수행하기 위한 형광 활성화 세포 분류기 또는 iii) 형광 수명 이미징을 수행하기 위한 다광자 현미경을 사용하여 자가형광 이미징을 통해 1차 성체 마우스 신경 줄기 세포 배양에서 세포 상태를 식별하고 강화하는 전략을 설명합니다.

초록

신경 줄기 세포(NSC)는 성인 신경 발생이라는 과정을 통해 성인 뇌에서 신생아 뉴런을 분열하고 생성합니다. 성체 NSC는 주로 정지 상태로, 세포 주기(G0)를 벗어났지만 환경에 계속 반응하는 가역적 세포 상태입니다. 성인 신경 발생의 첫 번째 단계에서 정지 NSC(qNSC)는 신호를 수신하고 활성화하여 정지 상태를 벗어나 세포 주기로 다시 진입합니다. 따라서 NSC 정지 및 정지 종료의 조절 요인을 이해하는 것은 성인 신경 발생을 목표로 하는 미래 전략에 매우 중요합니다. 그러나 NSC 정지에 대한 우리의 이해는 정지 NSC(qNSC) 및 활성화된 NSC(aNSC)를 식별하는 데 있어 기술적 제약으로 인해 제한됩니다. 이 프로토콜은 NSC 자가형광을 이미징하여 in vitro culture에서 생성된 qNSC 및 aNSC를 식별하고 강화하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 먼저, 이 프로토콜은 컨포칼 현미경을 사용하여 qNSC 및 aNSC의 자가형광 마커를 식별하여 자가형광 강도를 사용하여 NSC 활성화 상태를 분류하는 방법을 설명합니다. 둘째, 이 프로토콜은 FACS(Fluorescent Activated Cell Sorter)를 사용하여 NSC 활성화 상태를 분류하고 자가형광 강도를 사용하여 qNSC 또는 aNSC에 대한 샘플을 농축하는 방법을 설명합니다. 셋째, 이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 단일 세포 분해능에서 형광 수명 이미징(FLIM)을 수행하고, NSC 활성화 상태를 분류하고, 자가형광 강도와 형광 수명을 모두 사용하여 정지 출구의 역학을 추적하는 방법을 설명합니다. 따라서 이 프로토콜은 NSC 정지 및 정지 종료를 연구하기 위한 라이브 셀, 레이블이 없는 단일 셀 분해능 툴킷을 제공합니다.

서문

비소세포항(NSC)은 성인 신경발생(adult neurogenesis) ^1,2이라고 하는 과정을 통해 많은 유기체에서 일생 동안 신생아 뉴런을 생성합니다. 신생아 뉴런을 생산하기 위해서는 먼저 qNSC가 활성화되어야 하며, 세포주기에 들어가 개체군을 확장하고 신경 전구 세포를 생산해야 합니다 3,4,5,6. NSC 정지에 대해 많이 알려져 있지만, NSC 정지의 동인과 레귤레이터를 완전히 식별할 수 있는 능력은 qNSC와 활성화로의 전환을 격리 및 식별하기 위해 존재하는 기술적 제한으로 인해 제한됩니다. 자가형광 이미징은 이전에 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NAD(P)H) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD^)7,8와 같은 자가형광 대사 보조인자의 광학적 특성에 영향을 미치는 대....

프로토콜

이 프로토콜의 모든 절차는 위스콘신-매디슨 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 컨포칼 현미경을 사용하여 qNSC 및 aNSC의 PAF를 이미지화하여 NSC 세포 상태를 식별합니다.

1. 1차 NSC 배양에서 in vitro 에서 qNSC 및 aNSC를 생성합니다.
   1. 팽창을 위한 증식 배지에서 성인 마우스 뇌에서 정제된 배양 NSCs(표 1)18,20,21. 따라서 기본적으로 in vitro NSC 배양은 aNSC입니다.
   2. qNSC를 생성하려면 다음 프로토콜을 사용하여 코팅된 유리 제품에 aNSC를 도금한 다음 qNSC 배지로 처리하여 3일 동안 정지를 유도합니다.
   3. 먼저 접시 바닥을 덮기에 충분한 폴리-L-오르니틴(PLO, 플라스틱의 경우 물 10mg/mL, 유리의 경우 물 50....

결과

NSC 세포 상태를 분리하기 위한 공초점 자가형광 이미징(그림 1)
NSC 활성화 상태를 해결하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하기 위해, 앞서 설명한 바와 같이 활성화 매체 또는 정지 매체를 사용하여 시험관에서 qNSC 및 aNSC를 생성했습니다 10,13,17,18.

토론

이 프로토콜은 NSC에서 자가형광 신호의 이미징을 통해 시험관 내에서 NSC 세포 상태를 분류할 수 있는 살아있는 세포, 무표지, 비파괴, 단일 세포 분해능 기술을 설명합니다. 이 접근법은 NAD(P)H와 같은 대사 보조인자의 광학적 특성에 영향을 미치는 NSC 정지 종료 중에 발생하는 대사 변화를 감지하고 NSC 정지를 연구하기 위해 기존 기술에 비해 많은 이점을 제공합니?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
40x Water objective lens	Nikon	MRD77410	Objective lens used in multiphoton microscope in Part 3
8 well cuvette	Ibidi	80826-90	For imaging aNSCs/qNSCs
Analog power meter	Thorlabs	PM100A	Used in multiphoton microscope in Part 3
Antibiotic-Antimycotic (100X) (PSF)	Thermo Fisher	15240062	Antibiotic for NSC media
B-27	Invitrogen	17504044	Nutrient supplement for NSC media
BMP4	Fisher Scientific	5020BP010	Factor for inducing quiescence
Bovine serum albumin	Sigma	A4919-25G	For making BMP4
Chameleon ultrafast laser	Coherent	N/A	Laser used in multiphoton microscope in Part 3
Confocal microscope	Nikon	C2	Microscope used for Part 1
DMEM/F-12 (without GlutaMAX)	Invitrogen	11320033	Base media for NSCs
DNAse	Sigma	D5025-15KU	Added to trypsin inhibitor
EdU assay kit	Invitrogen	C10337	Proliferation assay for cell culture
EGF	PeproTech	AF-100-15-500UG	Growth factor for NSC media
FGF	PeproTech	100-18B	Growth factor for NSC media
Fluorescent activated cell sorter	BD	FACSAria	Fluorescent Activated Cell Sorter used for Part 2
Heparin	Sigma	H3149-50KU	Additive for NSC media
L-15	Invitrogen	21083027	For preparing trypsin inhibitor solution
Laminin	Sigma	L2020-1MG	For coating glassware
Nikon TiE inverted microscope	Nikon	N/A	Microscope frame Used for Part 3
PLO	Sigma	P3655-100MG	For coating glassware
SPC-150 Single photon counting electronics	Becker and Hickl	N/A	Used in multiphoton microscope in Part 3
Trypsin (for trypsinizing pellets of aNSCs that were growing as spheres or monolayers)	Gibco	15090046	For trypsinizing neurospheres or adherent aNSCs
Trypsin (for trypsinizing qNSCs)	Gibco	25200072	For trypsinizing adherent qNSCs
Trypsin inhibitor	Sigma	T6522-100MG	For inhibiting trypsinization of aNSCs
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Used to collect an IRF
Versene	Thermo Fisher	15040066	For preparing trypsin