인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

요약

근골격계 손상과 관련된 상처 치유에 대한 연구는 종종 슈완 세포 (SC), 각질 세포 및 섬유 아세포 간의 시험관 내 상호 작용의 평가를 필요로합니다. 이 프로토콜은 인간 포피로부터 이들 일차 세포의 분리, 배양 및 특성화를 기술한다.

초록

이 프로토콜은 피부의 신속한 효소 해리를 사용하여 높은 수율과 생존력을 가진 인간 일차 세포의 분리 방법, 배양 조건 및 특성화를 설명합니다. 일차 각질세포, 섬유아세포, 슈완 세포는 모두 인간 신생아 포피로부터 수확되며, 이는 표준 관리 절차에 따라 사용할 수 있습니다. 제거 된 피부는 소독되고 피하 지방과 근육은 메스를 사용하여 제거됩니다. 이 방법은 표피 및 진피 층의 효소 및 기계적 분리로 구성되며, 이어서 추가적인 효소 소화가 이뤄져 이들 피부 층 각각으로부터 단일 세포 현탁액을 얻는다. 마지막으로, 단일 세포는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 적절한 세포 배양 배지에서 성장하여 수주에 걸쳐 성장 및 생존력을 유지한다. 함께, 이 간단한 프로토콜은 피부-신경 모델의 시험관내 평가를 위해 단일 피부 조각으로부터 세 가지 세포 유형 모두를 분리, 배양 및 특성화할 수 있게 한다. 추가적으로, 이들 세포는 상처 치유와 관련된 배양물에서 로봇적으로 수행되는 스크래치의 형태로 서로에 대한 그들의 영향 및 시험관내 외상에 대한 그들의 반응을 측정하기 위해 공동 배양물에서 함께 사용될 수 있다.

서문

생체 조직으로부터 유래되고 시험관내 조건 하에서 배양된 1차 세포는 생리학적 상태¹과 매우 유사하여, 이들을 생리학적 및 병리생리학적 과정을 조사하기 위한 이상적인 모델이다. 피부는 각질세포, 섬유아세포, 세포세포, 멜라노사이트 및 슈완 세포(SCs)를 포함하는 다수의 세포 유형을 함유하며, 이는 시험관내 실험을 위해 단리되고 배양될 수 있다. 피부의 단일 조각으로부터 각질세포, 섬유아세포 및 SCs를 분리하고 배양하는 방법은 기술되지 않았다. 이 프로토콜의 목표는 두 가지입니다 : 1) 진피 SC의 분리 및 배양을위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 확립하고 2) 단일 인간 포피에서 각질 세포, 섬유 아세포 및 SC를 분리하기위한 효율적이고 강력한 방법을 사용하는 것입니다.

현재, 피부 각질세포 ^2,3,4 및 섬유아세포 ^5,6을 분리하기 위한 확립된 프로토콜이 있다. 이 연구는 피부로부터 각질세....

프로토콜

연구 목적으로 비확인 된 인간 포피 조직의 획득 및 사용은 Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574)에 의해 "인간이 아닌 연구"의 결정을 검토하고 받았다.

참고: 아래의 프로토콜에 따라, 2.4 x 10 6 각질세포, 4.4 x 10 6 섬유아세포 및 1.1 x 10⁶ SCs가 단일 포피로부터 수득된다. 일반적으로, 이들 일차 세포는 실험 조건에 따라 3계대 동안 사용될 수 있다.

1. 1차 세포 및 배양 조건의 분리

1. 표피와 진피 분리 절차
   1. 승인 된 병원 규제 프로토콜에 따라 의사의 치료 절차 표준에 따라 신생아 포피를 습득하십시오. 의사는 출생 후 할례의시기와 제거 된 피부의 양을 결정합니다.
   2. 적출된 포피를 빙냉 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 기본 배지 8-10 mL가 들어있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 포피를 즉시 세포 배양 실험실로 운반하여 세포를 분리합니다. 1x 항생제/항균제가 들어있는 둘베코의 인산완충식염수(DPBS) 20-25mL로 피부를 두 번 헹구....

결과

정상 신생아 포피는 원발성 표피 각질세포 및 진피 SC 및 섬유아세포의 단리를 위해 사용되었다. 단리된 일차 세포를 성장 인자를 함유하는 각각의 세포 배양 배지에서 배양하였다. 배양 플라스크에서 SCs 및 섬유아세포를 시딩한 후, 대부분의 세포는 2시간 이내에 플라스크의 바닥에 부착되었다. 각질세포의 경우, 대부분의 각질세포는 24 h에 의해 부착되었다. 분리된 표피 일차 각질세포는 7일째까.......

토론

이 프로토콜은 포피의 단일 조각, 즉 각질세포, 섬유아세포 및 슈완 세포로부터 세 개의 별개의 세포 집단을 분리하는 방법을 기술한다. 각질세포 및 섬유아세포^2,3,5,6을 분리하는데 이용가능한 몇 가지 분리 프로토콜이 있지만^, SC 단리를 기술하는 것은 없다. 피부, 각질세포 및 섬유아세포의 주요 구.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)	MilliporeSigma	SLGPR33RS
70 µM cell strainers	CELLTREAT	229483
100 µM cell strainers	CELLTREAT	229485
1 mL disposable syringes	BD Luer-Lok	BD-309659
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)	BD Luer-Lok	BD309646
10 mL disposable syringes	BD Luer-Lok	BD305462
1% TritonX-100	Sigma	X100-1L	Prepared at the time of use
4% paraformaldehyde solution	ThermoFisher Scientific	J19943.K2	Ready to use and store at 4 °C
5% BSA	Sigma	A7906-100G	Prepared at the time of use
70% ethanol	Pharmco	111000200
Antibiotic	ScienCell Research	503
Chemometec Vial1-Cassette	Fisher Scientific	NC1420193
Collagenase	Gibco	17018-029
Coverslip	Fisherbrand	12544D 22*50-1.5
Dispase I	Sigma-Aldrich	D46693
DMEM basal medium	ScienCell Research	9221
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)	Corning	21-031-CV)
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339653
1.5 mL micro-centrifuge tubes	Fisherbrand	02-681-5
Fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	10082147
Fibroblast complete medium	ScienCell Research	2331
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	Dilution (1:500)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	Dilution (1:500)
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer)	Lonza	CC-5022
Human foreskin			De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)	Lonza	00192151 and 00192152
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody	ThermoFisher Scientific	14-9760-82	Dilution (1:200)
Mouse Cytokeratin14 antibody	Abcam	ab7800	Dilution (1:100)
Mouse S100 antibody	ThermoFisher Scientific	MA5-12969	Dilution (1:200)
Multi chambered (4 well glass slide)	Tab-Tek	154526
NucleoCounter -Via1-Cassette	Chemometec	941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL)	ScienCell Research	32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36935
Rabbit K10 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4501656	Dilution (1:100)
Rabbit p75-NTR antibody	Millipore	AB1554	Dilution (1:500)
Rabbit vimentin	ProteinTech	10366-1-AP	Dilution (1:200)
Schwann cell culture medium	ScienCell Research	1701
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5	ROTH	LH75.1	Sterilize with 70% alcohol before use
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm)	Codman	54-6500	Sterilize with 70% alcohol before use
Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)	Razor blade company	94-0120	Sterilize with 70% alcohol before use
T25 culture flask	Corning	353109
Trypsin neutralization buffer (TNS)	Lonza	CC-5002
Trypsin/EDTA	Lonza	CC-5012
Inverted microscope	ZEISS	Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope	For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells
Inverted microscope	ZEISS	Primovert	For visulaizing/observing cell attachment or detachment