기능적 연구를 위한 인간 시냅틱 수용체를 재활성화하기 위한 시냅틱 멤브레인의 미세이식

요약

이 프로토콜은 Xenopus laevis 난모세포로 시냅스 막의 미세 이식을 수행함으로써 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 및 γ-아미노부티르산 수용체의 일관되고 신뢰할 수 있는 반응을 기록할 수 있음을 입증한다.

초록

흥분성 및 억제성 이온성 수용체는 생리적 뉴런 소통 동안 시냅스의 활성을 결정하는 이온 플럭스의 주요 게이트이다. 따라서 다른 시냅스 요소와의 풍부함, 기능 및 관계의 변화는 신경 퇴행성 질환 및 정신 장애의 뇌 기능 및인지 장애의 주요 상관 관계로 관찰되었습니다. 흥분성 및 억제성 시냅스 수용체의 기능이 질병에 의해 어떻게 변화되는지를 이해하는 것은 효과적인 치료법의 개발을 위해 매우 중요하다. 질병 관련 정보를 얻으려면 병든 인간의 뇌에서 기능적으로 남아있는 신경 전달 물질 수용체의 전기 활동을 기록하는 것이 중요합니다. 지금까지 이것은 수용체 기능의 병리학 적 변화를 평가하는 가장 가까운 접근법입니다. 이 연구에서는 Xenopus laevis 난모세포의 막으로의 주사 및 후부 융합에 의해 인간 수용체를 포함하는 스냅 얼어 붙은 인간 뇌 조직에서 시냅스 막을 재활성화시키는 것으로 구성된 시냅스 막의 미세 이식을 수행하는 방법론이 제시됩니다. 이 프로토콜은 또한 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산(AMPA) 및 γ-아미노부티르산(GABA) 수용체의 일관되고 신뢰할 수 있는 반응을 얻기 위한 방법론적 전략뿐만 아니라 정상화 및 엄격한 데이터 분석에 사용되는 새로운 상세한 방법을 제공한다.

서문

신경 퇴행성 장애는 인구의 많은 비율에 영향을 미칩니다. 그들의 파괴적인 결과는 잘 알려져 있지만, 뇌 기능에 중요한 신경 전달 물질 수용체의 기능적 변화와 증상 사이의 연관성은 여전히 잘 이해되지 않습니다. 개인 간 변동성, 질병의 만성 특성 및 교활한 증상 발병은 화학적 불균형이 잘 문서화 된 많은 뇌 질환에 대한 이해를 지연시킨 이유 중 일부일뿐입니다 ^1,2. 동물 모델은 귀중한 정보를 생성하고 진화 보존 시스템에서 생리학 및 병리 생리학의 기초가되는 메커니즘에 대한 지식을 확장했습니다. 그러나 설치류와 인간 사이의 여러 종 간 차이는 동물 모델에서 인간의 뇌로 수용체 기능의 직접적인 외삽을 배제합니다³. 따라서, 천연 인간 수용체를 연구하기 위한 초기 노력은 Ricardo Miledi의 실험실에서 외과적으로 제거된 조직과 동결된 샘플을 사용하여 개발되었다. 이 초기 실험은 신경 시냅스 및 여분의 시냅스 수용체뿐만 아니라 비 신경 전달 물질 수용체를 포함하는 전체 막을 사용했으며, 병든 상태에 대한 중요한 정보를 제공하지만 수용체의 혼합이 데이터 4,5,6....

프로토콜

모든 연구는 제도적 지침을 준수하여 수행되며 캘리포니아 어바인 대학 (IACUC-1998-1388)과 텍사스 대학 의료 지부 (IACUC-1803024)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 비알츠하이머병(AD) 뇌(여성, 74세, 사후 간격 2.8 h) 및 AD-뇌(여성, 74세, 사후 간격 4.5 h)로부터의 측두엽 피질은 캘리포니아 대학교 어바인 알츠하이머병 연구 센터(UCI-ADRC)에 의해 제공되었다. 뇌 기증에 대한 정보에 입각 한 동의는 UCI-ADRC에 의해 얻어졌습니다.

참고 : 고정되지 않은 인간의 뇌 조직은 혈액 매개 병원균 (BBP)의 원천으로 취급되어야합니다. 따라서, BBP 훈련은 실험을 시작하기 전에 필요하다. 이 프로토콜은 BSL2 요구 사항에 따라 생물 안전 레벨 2 (BSL2) 실험실에서 수행됩니다. 실험실 내의 지침 및 예방 조치에는 실험실에서 음식 또는 음료가 허용되지 않으며, 좋은 실험실 관행을 준수해야하며, 개인 보호 장비 (장갑, 가운, 발가락이 열린 신발 없음)가 필요하며 문을 항상 닫아야합니다.

1. 제노푸스 난모세포 미세주사 제제

1. 주사 바늘을 만들려면 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 3....

결과

주사 후 몇 시간 이내에 신경 전달 물질 수용체와 이온 채널을 운반하는 시냅스 막이 난모세포 원형질막과 융합되기 시작합니다. 도 1은 제노푸스 난모세포 내로 미세이식된 AMPA 및 GABA_A 수용체의 기록을 보여준다. 대부분의 분석을 위해, 샘플 당 두 개 또는 세 개의 난모세포로부터의 반응을 측정하고, 샘플 당 총 여섯 개에서 아홉 개의 난모세포에 대해 서로 ?.......

토론

인간 뇌의 천연 단백질 복합체 분석은 뇌 장애의 항상성 및 병리학 적 과정을 이해하고 질병을 예방하거나 치료하기위한 치료 전략을 개발하는 데 필요합니다. 따라서, 스냅 냉동 샘플을 함유하는 뇌 은행은 크고 대부분 미개척된 풍부한 생리학적 정보(^29,30)의 귀중한 공급원이다. 사후 조직을 사용하는 초기 관심사는 데이터의 해석을 혼란스럽게 할 수.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Microinjection
3.5" Glass Capillaries	Drummond	3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate	Thermofisher	FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller	Sutter	P-1000
Injection Dish	Thermofisher	08-772B
Microcentrifuge Tubes	Thermofisher	02-682-002
Mineral Oil	Thermofisher	O121-1
Nanoject II	Drummond	3-000-204
Nylon mesh	Industrial Netting	WN0800
Parafilm	Thermofisher	S37440
Stereoscope	Fisher Scientific	03-000-037
Syringe	Thermofisher	14-841-31
Ultrasonic cleaning bath	Thermofisher	FS20D
Xenopus laevis frogs	Xenopus 1	4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries	Sutter	B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter	Warner Instruments	LPF-8
Stereoscope	Fisher Scientific	03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation	Warner Instruments	TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller	Automate Scientific	SKU:01-18
WInEDR Free software	University of Strathclyde Glasgow	https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ	National Instruments	NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride	Thermofisher	C79
Calcium nitrate tetrahydrate	Thermofisher	C109
Collagenase	Sigma-Aldrich	C0130
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Thermofisher	BP310
Kainic acid	Tocris	0222
Magnesium sulfate heptahydrate	Thermofisher	M63
Potassium chloride	Thermofisher	P217
Sodium bicarbonate	Thermofisher	S233
Sodium chloride	Thermofisher	S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter,	Amicon