배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

요약

본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

초록

세포외 소포(EV)는 대부분의 세포 유형에서 방출되는 이질적인 막 나노입자이며 유기체 항상성의 생리학적 조절자 및 병리학의 중요한 지표로 점점 더 인식되고 있습니다. 한편, 접근 가능하고 통제 가능한 질병 치료제를 확립할 수 있는 엄청난 잠재력이 나타나고 있습니다. 중간엽 줄기 세포(MSC)는 배양 시 다량의 EV를 방출할 수 있으며, 이는 효과적인 조직 재생을 촉진하고 우수한 확장성과 재현성으로 광범위한 치료 적용을 촉진할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. MSC-EV를 수집하고 적용하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 여기서는 추가 응용 분야를 위해 배양된 인간 중간엽, 엑소좀 및 마이크로베지클에서 대표적인 EV를 분리하고 특성화하기 위해 차등 원심분리를 기반으로 하는 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 방법의 적응성은 라벨링, 국소 이식 및 전신 주입과 같은 일련의 다운스트림 접근 방식에 대해 표시됩니다. 이 절차의 구현은 중개 연구에서 간단하고 신뢰할 수 있는 MSC-EV 수집 및 적용의 필요성을 해결할 것입니다.

서문

줄기세포는 자가 재생 능력과 번역 잠재력이 있는 미분화 만능 세포입니다¹. 중간엽 줄기세포(MSC)는 실험실에서 쉽게 분리, 배양, 확장 및 정제되며, 이는 여러 번 계대배양한 후에도 줄기세포의 특성을 유지합니다. 최근 몇 년 동안, 중간엽 줄기세포가 치료적 용도에서 측분비 방식으로 작용한다는 견해를 뒷받침하는 증거가 증가하고 있다 ^2,3. 특히 세포외 소포체(EV)의 분비는 중간엽 줄기세포의 생물학적 기능을 매개하는 데 중요한 역할을 합니다. 대부분의 세포 유형에서 방출되는 이질적인 막 나노입자인 EV는 엑소좀(Exos), 미세소포(MV) 및 더 큰 세포자^멸사체(^4,5)라는 하위 범주로 구성됩니다. 그 중 엑소스는 40-150nm 크기로 가장 널리 연구된 EV로 엔도솜 기원이며 생리학적 조건에서 활발하게 분비됩니다. MV는 직경 100-1,000nm의 세포 원형질막 표면에서 직접 탈락하여 형성되며, 이는 포스파티딜세린의 높은 발현과 공여 세포의 표면 마커의 발현을 특징으로 한다⁶. EV에는 RNA,....

프로토콜

모든 동물 시술은 제4군 의과대학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원(National Institutes of Health Guide)의 실험 동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었습니다. 8주령의 C57Bl/6 마우스(암컷 또는 수컷 모두 선호 없음)를 사용했습니다. 본 연구에 사용된 냉동보존된 인간 탯줄 유래 중간엽(UCMSC)은 상업적 공급원으로부터 입수하였다( 재료 표 참조). 인간 세포의 사용은 제 4 군 의과 대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 배양

1. 피펫, 피펫 팁, 10cm 페트리 접시, 자동 온도 조절 장비(수조), 고무 장갑, 75% 알코올, 배양 배지(37°C에서 배양), 치명적인 소 혈청(FBS) 및 100x 페니실린-스트렙토마이신(P/S) 용액( 재료 표 참조).
2. 20% FBS와 1% P/S를 보충하여 시중에서 판매되는 α-MEM(alpha-Minimum Essential Medium)을 ....

결과

배양된 인간 UCMSC의 MV 및 엑소는 실험 워크플로우에 따라 분리됩니다(그림 1). NTA 결과는 인간 중간엽 줄기세포의 엑소 크기가 40nm에서 335nm까지 범위이고 피크 크기가 약 100nm이고 MV의 크기가 50nm에서 445nm이고 피크 크기가 150nm임을 보여줍니다(그림 2). MSC 유래 엑소의 형태학적 특성은 전형적인 컵 모양을 나타냅니다(그림 3). EV는 P.......

토론

EV는 항원 제시, 유전 물질 수송, 세포 미세 환경 변형 등을 포함한 다양한 생물학적 활동에서 중요한 역할을 하기 위해 부상하고 있습니다. 또한, 질병의 광범위한 적용은 질병의 진단과 치료를 위한 새로운 접근법과 기회를 제공한다²¹. EV의 치료 응용 구현은 성공적인 분리 및 특성화를 기반으로 합니다. 그러나 표준화된 분리 및 정제 방법의 부족과 낮은 추출 효율로 인해 EV 연?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% povidone-iodine (Betadine)	Weizhenyuan	10053956954292	Wound disinfection
Calibration solution	Particle Metrix	110-0020	Calibrate the NTA instrument
Carprofen	Sigma	53716-49-7	Analgesic medicine
Caudal vein imager	KEW Life Science	KW-XXY	Caudal vein imager
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Centrifugation
Fatal bovine serum	Corning	35-081-CV	Culture of UCMSCs
Formvar/carbon-coated square mesh	PBL Assay Science	24916-25	Transmission electron microscope
Heating pad	Zhongke Life Science	Z8G5JBMz	Post-treatment care of animals
Heparin Solution	StemCell	7980	Systemic injection
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22	Animal anesthesia
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Culture of UCMSCs
Nanoparticle tracking analyzer	Particle Metrix	ZetaView PMX120	Nanoparticle tracking analysis
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Resuspend EVs
Penicillin/Streptomycin	Procell Life Science	PB180120	Culture of UCMSCs
Phosphotungstic acid	Solarbio	12501-23-4	Transmission electron microscope
Pipette	Eppendorf	3120000224
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma-Aldrich	MINI26	Labeling EVs
Skin biopsy punch	Acuderm	69038-10-50	Skin defects
Software ZetaView	Particle Metrix	Version 8.05.14 SP7
Thermostatic equipment	Grant	v-0001-0005	Water bath
Transmission electron microscope	HITACHI	HT7800	Transmission electron microscope
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	Commercially UCMSCs
Ultracentrifuge	Beckman	XPN-100	Centrifugation
Ultrapure filtered water purification system	Milli-Q	IQ 7000	Preparation of ultrapure water