생체 내 마우스 턱밑샘의 혈관 투과성 검출

요약

본 프로토콜에서, 턱밑샘(SMG)의 내피 장벽 기능은 이광자 레이저 스캐닝 현미경 하에 생체 내에서 시험 동물 모델의 각 정맥에 상이한 분자 가중 형광 추적자를 주입함으로써 평가되었다.

초록

타액은 구강 및 전반적인 건강에 중요한 역할을합니다. 혈관의 손상되지 않은 내피 장벽 기능은 타액 분비를 가능하게하는 반면, 내피 장벽 기능 장애는 많은 타액선 분비 장애와 관련이 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 턱밑샘 (SMG)에서 내피 조밀 접합부 (TJ)의 기능을 평가하기 위한 생체내 초세포 투과성 검출 방법을 기술한다. 먼저, 상이한 분자량 (4 kDa, 40 kDa 또는 70 kDa)을 갖는 형광 표지 된 덱스 트란을 마우스의 각 정맥에 주입 하였다. 그 후, 일방적 인 SMG를 해부하여 2 광자 레이저 스캐닝 현미경으로 맞춤형 홀더에 고정 한 다음 혈관, acini 및 덕트에 대한 이미지를 캡처했습니다. 이 방법을 사용하여 혈관에서 acini의 기저측으로, 심지어 acinar 상피를 가로질러 덕트로 다양한 크기의 추적자의 실시간 동적 누출을 모니터링하여 생리적 또는 병리생리학적 조건에서 내피 장벽 기능의 변화를 평가했습니다.

서문

다양한 타액선은 주로 감염에 대한 첫 번째 방어선 역할을하고 소화를 돕는 타액을 생성하여 구강 및 전반적인 건강에 필수적인 역할을합니다¹. 혈액 공급은 일차 타액을 형성하는 물, 전해질 및 분자를 지속적으로 제공하기 때문에 타액선 분비에 중요합니다. 단단한 접합 (TJ) 복합체에 의해 조절되는 내피 장벽 기능은 물, 용질, 단백질 및 순환 혈관에서 타액선 조직으로 이동하는 세포에도 투과성이 높은 모세 혈관의 투과를 엄격하고 섬세하게 제한합니다 ^2,3. 우리는 이전에 콜린성 자극에 반응하여 내피 TJ의 개방이 타액 분비를 촉진하는 반면, 내피 장벽 기능의 손상은 쇼그렌 증후군⁴의 턱밑샘(SMG)의 저분비 및 림프구 침윤과 상호 연결되어 있음을 발견했습니다. 이러한 데이터는 내피 장벽 기능의 기여가 다양한 타액선 질환에 대해 충분한주의를 기울일 필요가 있음을 시사합니다.

이광자 레이저 스캐닝 현미경은 생체 내 온전한 조직에서 세포의 역학을 관찰하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술의 장점 중 하나는 표본이 NIR에 의해 여기될 때 근적외선(N....

프로토콜

모든 실험 절차는 북경대학 보건과학센터 동물연구윤리위원회의 승인을 받았으며 실험동물의 관리 및 사용 가이드(NIH 간행물 제85-23호, 1996년 개정)를 준수했습니다. 8-10주의 연령 그룹의 수컷 야생형(WT) 마우스를 본 연구에 사용하였다. 실험동물은 통증과 불편함을 최소화하기 위해 조심스럽게 처리하였다.

1. 동물 절차

1. 마취제와 추적자를 준비하고 투여하십시오.
   1. 연구 전반에 걸쳐 멸균 상태를 유지하고 오토클레이빙을 통해 기기를 멸균합니다. 마우스를 두 그룹으로 나눕니다.
      참고: 대조군은 치료하지 않은 상태로 두었고, 1일 동안 일방적 SMG 덕트 결찰을 받은 다른 그룹은 실험군으로 봉사했습니다. 그룹화 할 때, 체중과 연령이 혈관 투과성에 미치는 영향을 줄이기 위해 체중과 나이가 비슷한 마우스를 선택해야합니다.
   2. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 덱스트란(분자량: 4kDa; FD4) 및 로다민 B 표지된 덱스트란(분자량: 70 kDa; RD70) ( 재료 표 참조) 투과성 분석을 위해 형광 신호 간의 간섭을 최소화하기 위해 (각각 FITC 또는 로다민 B 필터 사용) 별개의 여기/방출 스펙트럼을 사용합니다.<....

결과

프로토콜에 따라 일방적 인 SMG는 맞춤형 홀더에 부착되었으며 글 랜드는 호흡이 운동 아티팩트를 일으키지 않도록 마우스 몸에서 최대한 멀리 유지되었습니다. 혈관에서 적혈구 (검은 점)의 빠른 흐름을 현미경으로 관찰했습니다. 안구 렌즈 아래에서 조직 필드를 찾은 후에는 현미경 소프트웨어를 조작하도록 전환해야 합니다. 대조군에서는 두 추적자 모두 마우스 SMG의 혈관에 존재했습니다. 특?.......

토론

내피 장벽 기능의 유지 및 조절은 혈관 항상성에 필수적입니다. 내피 세포와 그 세포 간 접합부는 혈관 완전성을 유지하고 제어하는 데 중요한 역할을합니다¹². 혈류의 전단력, 성장 인자 및 염증 인자는 혈관 투과성의 변화를 일으킬 수 있으므로 고혈압, 당뇨병 및자가 면역 질환과 같은 전신 질환의 발생 및 발달에 참여할 수 있습니다^13,14,15

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE)	Leica, Germany
4 kDa FITC-labeled dextran	Sigma Aldrich	46944
70 kDa rhodamine B-labeled dextran	Sigma Aldrich	R9379
Blunt tissue separation nickel	Bejinghuabo Company	NZW28
Depilatory cream	Veet
Disposable sterile syringe	Zhiyu Company		1 mL
Image J software	National Institutes of Health
Insulin syringe	Becton, Dickinson and Company	0253316	1 mL
Leica Application Suite X software	Leica Microsystems
Microtubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Phosphate buffered saline 1x	Servicebio	G4207-500
Tissue scissors	Bejinghuabo Company	M286-05
Tribromoethanol	JITIAN Bio	JT0781