Teleost 모델의 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석 일본 메다 카 (Oryzias latipes)

요약

이 기사에서는 작은 모델 물고기 medaka (Oryzias latipes)에서 정자를 수집하는 두 가지 빠르고 효율적인 방법과 컴퓨터 보조 정자 분석 (CASA)을 사용하여 정자의 질을 안정적으로 평가하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

일본 medaka (Oryzias latipes)는 teleost 물고기이며 생태 독성학, 발달, 유전학 및 생리학 연구를위한 새로운 척추 동물 모델입니다. Medaka는 또한 종이 영속할 수 있도록 하는 필수적인 생물학적 기능인 척추동물 번식을 조사하는 데 광범위하게 사용됩니다. 정자의 질은 남성의 생식력과 번식 성공의 중요한 지표입니다. 정자 추출 및 정자 분석 기술은 teleost 물고기를 포함한 많은 종에 대해 잘 문서화되어 있습니다. 정자 수집은 큰 물고기에서는 비교적 간단하지만 작은 모델 물고기에서는 정자를 덜 생산하고 더 섬세하기 때문에 더 복잡 할 수 있습니다. 따라서이 기사에서는 작은 모델 물고기 인 일본 메다 카에서 정자 수집의 두 가지 방법, 즉 고환 해부와 복부 마사지에 대해 설명합니다. 이 논문은 두 가지 접근법 모두 medaka에 대해 실현 가능하다는 것을 보여 주며 물고기가 절차에서 빠르게 회복됨에 따라 복부 마사지를 반복적으로 수행 할 수 있음을 보여줍니다. 이 기사는 또한 medaka 정자 품질 (운동성, 진행성, 운동성 지속 기간, 상대 농도)의 몇 가지 중요한 지표를 객관적으로 평가하기 위해 medaka의 컴퓨터 보조 정자 분석 프로토콜을 설명합니다. 이 유용한 소형 teleost 모델에 대해 지정된 이러한 절차는 척추 동물 남성의 생식력에 영향을 미치는 환경, 생리 학적 및 유전 적 요인에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.

서문

일본 메다카는 동아시아가 원산지인 작은 알을 낳는 민물 텔레오스트 물고기입니다. Medaka는 생태 독성학, 발달 유전학, 유전체학, 진화 생물학 및 생리학 연구 ^1,2를위한 우수한 척추 동물 모델 시스템이되었습니다. 인기있는 제브라 피쉬와 유사하게, 그들은 번식하기 쉽고 많은 일반적인 물고기 질병 ^1,2에 매우 강합니다. 짧은 생성 시간, 투명한 배아 ^1,2 및 시퀀싱 된 게놈³을 포함하여 medaka를 모델로 사용하면 몇 가지 이점이 있습니다. 제브라 피쉬와 달리 메다 카는 성 결정 유전자 4뿐만 아니라 고온 (^4-40 ° C) 및 염분 (유리할린 종) 내성⁵을 가지고 있습니다. 또한 생물학 연구를 용이하게하기 위해 프로토콜 6,7,8,9,10,11,12뿐만 아니라 많은 유전 및 해부학 적 도구가 medaka....

프로토콜

모든 실험 및 동물 취급은 노르웨이 생명 과학 대학 (NMBU)의 실험 동물 복지에 대한 권고에 따라 수행되었습니다. 실험은 NMBU (노르웨이 Ås)에서 자란 성인 (6-9 개월) 수컷 일본 메다 카 (Hd-rR 균주)를 사용하여 수행되었습니다. 이 방법은 또한 국립 농업, 식품 및 환경 연구소 (INRAE, Rennes, France)에서 자란 9 개월 된 수컷 일본 메다 카 (CAB 균주)에서 간단히 테스트되었습니다.

1. 기기 및 용액 준비

1. 마취 원액 (0.6 % 트리 카인)을 준비하십시오.
   1. 0.6x 인산염 완충 식염수(PBS) 100mL에 트리카인(MS-222)을 희석합니다.
   2. 마취 원액 2mL를 50 2 mL 플라스틱 튜브에 분취하고, 마취 또는 안락사에 사용될 때까지 -20°C에서 보관한다.
2. 회수수 (0.9 % 염화나트륨 [NaCl] 용액)를 준비하십시오.
   1. 3 L의 수족관 물에 27 g의 NaCl을 첨가하십시오.
   2. 사용할 때까지 용액을 실온(RT)에서 보관하십시오.
3. 필요한 경우 활성화 매체를 조정하십시오 (행크의 균형 잡힌 소금 용액 [HBSS]....

결과

얻은 데이터 유형
SCA Evolution 소프트웨어의 정자 운동성 분석은 운동성(운동성 및 고정성 정자의 백분율), 진행성(진행성 및 비진보성 정자의 백분율) 및 속도(급속, 중간 및 느리게 움직이는 정자의 비율)에 대한 데이터를 제공합니다. 또한 프로그레시브와 속도(빠른 프로그레시브, 중간 프로그레시브, 비프로그레시브)를 결합합니다. 이 라벨은 프로그램 (보충 표 1)에서.......

토론

삼투압은 물고기 정자^36,37의 활성화에 중요한 요소입니다. 일반적으로, 정자는 고환에서 움직이지 않으며, 해양 어류의 경우 정액에 비해 고 삼투압 인 배지에서 운동성이되고, 민물 고기의 경우 정액에 비해 저 삼투압 (hypo-tricomtic)이됩니다³⁷. 혈액과 유사하게, 민물 고기의 정액 혈장은 일반적으로 해양 어류보다 낮습니다 (400 mOsmol / k.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040