9 일 된 마우스 신생아의 간외 담관 및 담낭 박리

요약

쥐 신생아 담관 장애를 관찰하려면 손상되지 않은 담관과 효율적인 준비가 필요합니다. 따라서 쥐 신생아에서 전체 간외 담관 시스템을 분리하기위한 새로운 접근법이 담관의 완전성을 유지하면서 성공적으로 개발되었습니다.

초록

쥐 신생아 담관의 해부는 어려운 것으로 묘사되었습니다. 설명 된 표준 수술 절차의 주요 목적은 준비 중에 담관을 손상시키지 않고 마우스 신생아에서 간외 담관 (EBD)을 분리하는 것입니다. 담관 세포 세포주와 비교하여 예외적으로 가까운 준비 및 전체 간외 담관 시스템 (EBDS)의 수확으로 인해 설명 된 접근법은 담도 폐쇄증과 같은 신생아 담관 장애의 동물 모델을 연구하는 데 매우 유용합니다. 안락사 후 복강에 접근하고 담관 시스템, 십이지장 및 간을 독특한 En-bloc-Reclause (EbR)로 추출했습니다. 추출된 샘플을 폼 매트 위에 놓고 EBD를 오염된 세포에서 해부하여 필요한 접촉 없이 외상으로 제거합니다. 전체 EBDS의 해부는이 방법의 중요한 이점입니다. 담관 조직의 크기와 양이 작기 때문에주의를 기울여야합니다. 설명 된 기술을 사용하면 담관 세포에 손상이 없습니다. 또한, 기술의 순도는 재현 가능하다 (n = 10). 따라서 최적으로 비교 가능한 샘플을 수확 할 수 있습니다. 또한 담관 조직에는 담즙 조직이 손상되지 않는데, 이는 준비 중에 담관 시스템과의 접촉을 피할 수 있기 때문에 담낭 내부에 담액이 남습니다. 가장 중요한 것은 최종 담낭 및 담관 박리를 수행하는 동안 외상성 미세 도구를 압박하지 않고 담관의 약간 측면에서만 사용했습니다. 이것은 깨끗하고 손상되지 않은 샘플의 핵심이며 추가 조직 학적 조사 또는 담관 세포의 분리에 필수적입니다. 요약하자면, 설명된 혁신적인 해부 기술을 통해 필요한 장비를 갖춘 특히 경험이 없는 작업자가 EBDS를 가능한 한 깨끗하게 격리할 수 있습니다.

서문

담도 폐쇄증, 원발성 경화성 담관염(PSC) 및 원발성 담즙성 담관염(PBC)과 같은 담관병증의 기원과 진행은 알려지지^{않았거나 불완전합니다1,2}. 이러한 질병의 기원과 진행에 대한 제한된 이해는 치료 옵션의 부족으로 이어집니다³. 신생아 담관 장애를 연구하는 데 가장 어려운 장애물은 병태생리학에 대한 분자적 이해를 얻는 것입니다. 분자 병리학을 더 잘 이해하기 위한 필수 열쇠 중 하나는 영향을 받은 조직을 최대한 관찰하는 것입니다. 담도 폐쇄증⁴의 잠재적 인 바이러스 병인을 관찰하는 것과 같은 연구 간의 비교 가능성 및 불일치 감소를 피하기 위해, 수행 된 해부 기술의 최상의 준비 및 공유가 필요합니다. 표적 조직의 순수한 준비는 나중에 현미경 조사 또는 세포 및 3D 오가노이드 배양 육종에 필요합니다. 그러나 쥐 신생아 장애에서 조직 샘플은 드물고 크기가 매우 작기 때문에 소량 만 발생합니다. 담관 장애와 관련하여 쥐 신생아에서 담관을 깨끗하게 준비하는 데 어려움이 설명되었습니다⁵. 신생아 발달 단계로 인해 조직 분화가 지나치게 진행되지 않아 성인 샘플 준비에....

프로토콜

윤리적 승인(N045/2021)에 따라 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스 신생아를 9일령까지 관찰했습니다. 동물들은 독일 함부르크의 함부르크-에펜도르프 대학 의료 센터의 동물 시설에서 실험 목적으로 태어나 제공되었습니다. 신생아는 부모 동물과 함께 새장에 수용되었습니다. 환경 조건은 온도 (20-24 ° C), 12:12 h 명암 사이클 및 40 % -70 %의 상대 습도로 제어되었습니다.

1. 실험 준비

1. 가위, 집게 등을 포함하여 외과 수술에 필요한 장비를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
2. 소독 및 오토클레이브된 기구를 수술 테이블 옆의 멸균 표면에 놓습니다.
3. P9 세 신생아 마우스를 수술 가위로 참수하여 신속하게 안락사시킵니다. 안락사된 신생아 마우스의 시신을 멸균 수술장에 놓습니다. 생후 9일 된 마우스 신생아의 EBDS를 해부합니다(5단계).
   참고: 설명된 해부 절차는 모든 과학자에게 신생아 및 노령 마우스에서 EBDS를 제거할 수 있는 적절한 도구를 제공합니다. 마우스가 오래 될수록 준비가 더 쉽습니다.

2. 복강에 대한 접근<....

결과

도 1A 는 뮤린 신생아의 EBDS를 보여주며, 이는 기술된 기술로 해부되었다. 현미경으로 볼 때 더 이상 간 조직이 보이지 않습니다. 간 조직은 프로토콜의 최종 분리 단계에서 제거되었으며 색상 및 일관성과 관련하여 담관 조직과 쉽게 구별 될 수 있습니다. 그림 1B 는 밀리미터 스케일과 비교하여 분리된 샘플을 보여줍니다. EBD의 길이(담낭에서 십이지장 .......

토론

이 기사는 안락사된 신생아 마우스의 EBDS를 제거하기 위한 새로운 외과적 접근법의 생성 및 검증을 보고하고 논의했습니다. 현미경 및 조직학적 결과는 이 접근법이 EBD를 신속하게 감지하고 신생아 마우스에서도 덕트 가장자리 근처에서 해부한다는 것을 보여줍니다. 설명 된 프로토콜에는 수술 도구와 20 배 배율의 현미경 만 필요합니다. 또한 이 접근 방식을 통해 전체 EBDS를 격리할 수 있습니다........

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	used as a dehydrating agent
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula for hydration of the sample
Air vent	C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany	Tec-Ononmic AZ 1200	the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Germany	2351744	saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany	12612613	used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	TT56.1	sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes	Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-6660-00	staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut	FST, Heidelberg Germany	14959-09	Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Germany	11051-10	Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-5130-00	staining solution, ready to use
Highresolotion microscope	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany	BX60F5
Microscope Cover Glases	Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	101244	60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany	03-0060
Microtome	Leica, Nußloch, Germany	SM2010R	Tool for sectioning (2 µm-slices)
Omnifix-F 1 mL syringe	B Braun, Melsungen, Germany	9161406V	syringe without canula
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	TES 99	The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4
Small Microsurgical Forceps	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany	(00)165	Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler	Agntho's AB, Lidingö, Sweden	30085-15	150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation	FST, Heidelberg Germany	14001-14	Device for decapitation
Warming cabinet	Haraeus, Hanau, Germany	T 6060	the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides