Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

요약

이 프로토콜은 3D 콜라겐 하이드로겔(두께 <250μm)에서 섬유를 정렬하기 위해 확장 변형(스트레칭)을 생성하기 위해 유체 흐름 방향을 따라 기하학이 변화하는 미세유체 채널의 사용을 보여줍니다. 결과 정렬은 수 밀리미터에 걸쳐 확장되며 연신 변형률의 영향을 받습니다.

초록

정렬된 콜라겐 I(COL1) 섬유는 종양 세포 운동성을 안내하고, 내피 세포 형태에 영향을 미치고, 줄기 세포 분화를 제어하며, 심장 및 근골격계 조직의 특징입니다. 시험관 내에서 정렬된 미세 환경에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 자기, 기계, 세포 기반 및 미세유체 방법을 포함하여 정의된 섬유 정렬을 가진 COL1 매트릭스를 생성하기 위한 여러 프로토콜이 개발되었습니다. 이 중 미세유체 접근법은 유체 흐름 및 세포 미세 환경에 대한 정확한 제어와 같은 고급 기능을 제공합니다. 그러나 고급 체외 배양 플랫폼을 위해 정렬된 COL1 매트릭스를 생성하기 위한 미세유체 접근 방식은 500μm 미만의 거리에 걸쳐 확장되고 3D 세포 배양 응용 분야에 도움이 되지 않는 COL1 섬유의 얇은 "매트"(두께 <40μm)로 제한되었습니다. 여기에서 우리는 미세유체 장치에서 정의된 섬유 정렬의 밀리미터 규모 영역을 가진 3D COL1 매트릭스(두께 130-250μm)를 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 플랫폼은 세포 배양을 위한 미세 엔지니어링 매트릭스에 직접 액세스할 수 있도록 하여 구조화된 조직 미세 환경을 모델링하는 고급 세포 배양 기능을 제공합니다.

서문

세포는 세포외 기질(ECM)이라고 하는 복잡한 3D 섬유 네트워크에 존재하며, 그 대부분은 구조 단백질 콜라겐 유형 I(COL1^)1,2로 구성됩니다. ECM의 생물물리학적 특성은 세포에 안내 신호를 제공하고, 이에 대한 반응으로 세포는 ECM 마이크로아키텍처 ^3,4,5를 리모델링합니다. 이러한 상호 세포-매트릭스 상호작용은 종양 환경(^7,8,9)에서 혈관신생 및 세포 침윤을 ^{촉진하고 세포} 형태^(10,11,12), 분극(13) 및 분화(¹⁴)에 영향을 미치는 정렬된 COL1^{섬유 도메....}

프로토콜

1. 2피스 채널 및 모듈식 플랫폼 베이스 제작

참고: 미세유체 채널은 정의된 두께의 폴리디메틸 실록산(PDMS) 시트에서 면도날로 절단된 미세유체 채널 "컷아웃"과 컷아웃에 가역적으로 결합되어 채널을 형성하는 채널 덮개의 두 부분을 사용하여 구성됩니다. 채널은 미디어 저장소 역할을 하는 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 프레임으로 둘러싸여 있습니다(그림 1). PMMA 프레임은 추가 기능을 위해 특수 모듈을 자석으로 래치하는 데에도 사용할 수 있습니다.

1. PDMS 시트의 면도기 절단 채널:
   참고: 이 단계를 위한 미세유체 채널 설계는 보충 그림 1에 나와 있습니다. 채널은 각각 길이 5mm, 폭 10mm, 5mm, 2.5mm, 1.25mm 및 0.75mm의 5개 세그먼트로 구성됩니다. 일정한 유속(50-400 μL·^min-1)으로 주입된 콜라겐 용액의 속도는 채널 폭이 감소하여 확장 흐름을 생성함에 따라 채널을 따라 국부적으로 증가합니다.
   1. 250μm 두께의 PDMS 시트를 플라스틱 캐리어 시트에 장착하고 크래프트 커터를 사용하여 0.5mm의 블레이드 깊이, 1cm·

결과

자체 조립 COL1 용액이 단면적이 감소하는 채널을 통해 흐를 때 COL1 용액의 유속 속도(_vx)는 두 세그먼트(∂x) 사이의 수축 길이를 따라 크기 ∂v x만큼 국부적으로 증가하여 ε̇ = ∂v x/∂_x인 확장 변형률(ε̇)이 발생합니다. 연신 변형률은 그림 2에서 볼 수 있듯이 입자 이미지 유속계(PIV)를 사용하여 측정되는 유체 속도에서 계산할 수 있습니다.

토론

정렬된 섬유를 갖는 COL1 매트릭스를 생성하기 위한 프로토콜은 자기 방법, 기계적 변형의 직접적인 적용, 및 미세유체 기술⁴⁷을 사용하여 설명되었다. 미세유체 접근법은 생화학적 미세 환경을 정밀하게 제어할 수 있는 잘 정의된 흐름 및 수송 특성으로 인해 미세생리학적 시스템을 만드는 데 일반적으로 사용됩니다. 정렬된 COL1 섬유는 상처 치유, 종양 세포 침습 및 조직 발달과 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)	Sigma Aldrich	440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip	Jensen Global	JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet	KJ Magnetics	D31
3M (TC) 12X12-6-467MP	DigiKey	3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5%	Signa Aldrich	179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER	Electro-Technic Products	12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar	VWR	AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested	VWR	45000-666
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
CT-FIRE software	LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL	Lonza	CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL	VWR	VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50	Graphtec	CE LITE-50
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer	McMaster-Carr	87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells	Thermo Fisher Scientific	C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T10282
Isopropanol	Fisher Scientific	A4154
Laser cutter	Full Spectrum	20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump	New Era Syringe Pumps	NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E	Gilson	FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen	Advanced BioMatrix	5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4	VWR	70011044.00
PBS pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100	Alfa Aesar	J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20	USCUTTER	GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip	Restek	22766.00
Silicon wafer	University wafer	452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g	VWR	BDH9292-500G
Sylgard 184	VWR	102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352.00